哈維氏弧菌毒性相關(guān)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)解析及遲緩愛德華氏菌磷脂酶D的初步研究.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是支撐我國國民經(jīng)濟(jì)的一個(gè)重要支柱,近些年來得到飛速發(fā)展。目前我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量已居世界首位。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)給我國帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益,從一定程度上緩解了糧食壓力。從長遠(yuǎn)來看,大力發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不僅是我國今后努力的方向,也是對全球意義重大的戰(zhàn)略性決策。然而隨著近些年來水產(chǎn)養(yǎng)殖的方式逐漸由粗放式向集約式轉(zhuǎn)化,水產(chǎn)動(dòng)物病害日趨嚴(yán)重,其造成的損失也處于上升趨勢,各種抗生素的使用更加速了抗藥性病原菌的富集,給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治帶來了巨大的困

2、難。本研究從基因功能的角度對危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的兩大病原菌一哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)進(jìn)行了初步研究。
　　 前期的研究已經(jīng)證實(shí)哈維氏弧菌對鮭魚的致病性與其分泌的胞外產(chǎn)物中的溶血素相關(guān)。致病力最強(qiáng)的菌株VIB645有2個(gè)堿基序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,而其它的菌株僅有1個(gè)溶血素基因或無此基因。vhhA和vhhB分別位于染色體DNA和一個(gè)大小約為6

3、5.6 kb的質(zhì)粒上(命名為pVH1)。這2個(gè)基因的堿基序列非常相似(相似度98.8％),其預(yù)測編碼的氨基酸序列完全相同,并與副溶血弧菌的TLH溶血素的氨基酸序列有高度的相似性(相似性85.6％)。
　　 本研究用堿裂解法提取該菌株的毒性相關(guān)質(zhì)粒pVH1,利用多種限制性內(nèi)切酶(BglⅡ,HindⅢ,MboⅠ,SacⅠ,NcoⅠ和PstⅠ)進(jìn)行酶切,以pUC19c質(zhì)粒為載體構(gòu)建隨機(jī)DNA文庫并測序。共獲得28個(gè)克隆片斷,合計(jì)測序9

4、7.63kb,約覆蓋質(zhì)粒1.483倍。采用ORF—finder軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,共鑒定出125個(gè)ORF(大于150 bp),其中79個(gè)ORF與數(shù)據(jù)庫中已知基因具有較高同源性,37個(gè)ORF具有部分同源性,另有9個(gè)ORF在數(shù)據(jù)庫中未找到相似序列,認(rèn)為是潛在的新基因。所有預(yù)測的ORF,根據(jù)其功能主要分為以下幾類:(1)毒力相關(guān)基因,包括RTX(repeats in toxin)毒素鈣離子結(jié)合蛋白基因,轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白A前體蛋白基因和外膜粘附

5、蛋白PilT菌毛基因。三者分別參與RTX毒素與鈣離子的結(jié)合,致病菌的攝鐵系統(tǒng)和致病菌在體內(nèi)的定殖；(2)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因,包括TraC、-D、-F、-G、-H、-I、-K、-N、-U、-W、TrbB、-C,細(xì)菌的生存能力或者毒力可通過接合作用得到增強(qiáng)；(3)轉(zhuǎn)座相關(guān)基因；(4)其他功能基因,如甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA結(jié)合蛋白、亞硝酸鹽擠壓蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、脂蛋白、肽酶、DNA復(fù)制蛋白等與細(xì)菌正常生長代謝相關(guān)的基因；(5)未知基因。大部分的

6、基因?qū)儆诩俣ǖ鞍?功能未知。所測得的基因序列大多與創(chuàng)傷弧菌CECT4999攜帶的毒性質(zhì)粒pR99、創(chuàng)傷弧菌CECT4602攜帶的接合質(zhì)粒pC4602-2以及創(chuàng)傷弧菌YJ016攜帶的質(zhì)粒pYJ016有著較高的同源性。
　　 目前對遲緩愛德華氏菌致病機(jī)理的研究尚缺乏詳盡清晰的闡述,很多毒力基因還有待發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選取了遲緩愛德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株EIB202基因組上一個(gè)編碼磷脂酶D超級(jí)家族蛋白的基因即PLD基因進(jìn)行了初步研究。該基因全長12

7、45 bp,編碼414個(gè)氨基酸,從預(yù)測的基因編碼的氨基酸序列上看,該蛋白具有磷脂酶D超級(jí)家族共有的兩個(gè)HKD保守區(qū),分別位于第137-161位氨基酸和第344-368位氨基酸處。本研究采用自殺質(zhì)粒pRE118介導(dǎo)的同源重組技術(shù),構(gòu)建與PLD基因同源的缺失片段,將其導(dǎo)入并整合到野生菌株中的染色體上,再利用篩選壓力選出由于同源重組而發(fā)生PLD基因缺失的突變株,然后對突變株的致病性及表型做了初步研究。結(jié)果表明磷脂酶D超級(jí)家族蛋白對遲緩愛德華氏