致病性遲緩愛德華氏菌的鑒定、PCR檢測及esaC基因的功能鑒定.pdf

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性腸道菌，感染宿主范圍廣。由該菌引起的愛德華氏菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖最常見的傳染病之一，給水產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究從發(fā)病大菱鲆分離和鑒定了2株遲緩愛德華氏菌，建立了致病性遲緩愛德華氏菌的PCR檢測方法，對esaC基因的功能進行了鑒定，構建了遲緩愛德華氏菌的三個基因缺失突變株并進行初步鑒定，為將來用于篩選減毒活疫苗打下基礎。主要結(jié)果如下： 一、遲緩愛德華氏菌的分離

2、鑒定：從兩個養(yǎng)魚場的發(fā)病大菱鲆分離得到了2株優(yōu)勢菌JN和MHK2。人工感染大菱鲆實驗表明JN和MHK2對魚的半數(shù)致死濃度(LD50)分別為105.4cfu/ml和105.6cfu/ml。對JN和MHK2的16s rDNA序列分析表明，它們與遲緩愛德華氏菌的序列相似性為99％。API ID32E生理生化檢測表明，它們與標準遲緩愛德華氏菌的各項反應指標高度一致。因此將JN和MHK2鑒定為遲緩愛德華氏菌。 二、致病性遲緩愛德華氏菌的P

3、CR檢測：以遲緩愛德華氏菌的主要毒力因子-Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的裝置蛋白基因esaV、過氧化氫酶基因katB為靶基因，設計特異性引物用于遲緩愛德華氏菌PCR檢測。結(jié)果表明，在11株致病性菌中都檢測到了esaV和katB基因的存在；在13株非致病性菌株中均沒有檢測到esaV基因，有4株檢測到katB基因。根據(jù)上述結(jié)果，esaV基因可以作為區(qū)分致病性和非致病性遲緩愛德華氏菌的一個分子標記。 三、esaC基因的功能鑒定：遲緩愛德華

4、氏菌T3SS的1個裝置蛋白。本研究采取基因缺失突變技術，構建了esaC基因缺失突變株。Westemblotting分析表明，由于esaC基因的缺失，遲緩愛德華氏菌T3ss的輸送器蛋白(EseB，EseC，EseD)雖然可以正常的表達，但是不能分泌到細胞外，同時細菌的自凝聚現(xiàn)象消失。毒力檢測發(fā)現(xiàn)，突變株對藍曼龍魚的半數(shù)致死濃度(LD50)比野生型菌株提高了10倍。結(jié)果表明，esaC基因影響遲緩愛德華氏菌的毒力和T3SS相關蛋白的分泌。本研

5、究進一步確定了esaC基因作為遲緩愛德華氏菌T3SS裝置蛋白的功能，加深了對遲緩愛德華氏菌致病機理的了解。 四、三基因缺失突變株的構建和初步鑒定：利用基因缺失突變技術，構建了遲緩愛德華T3SS基因esrB、T6SS(Ⅵ型分泌系統(tǒng))基因evpH、芳香族氨基酸合成酶基因aroA的三基因缺失突變株。人工感染實驗表明，該突變株的毒力大大下降，LD50>108cfu/ml。細菌在魚體內(nèi)存活實驗表明，該突變株細菌在牙鲆魚體內(nèi)的存活時間不超過