偽狂犬病毒和豬傳染性胃腸炎病毒誘導β干擾素產生的分子機制研究.pdf

1、病毒感染與宿主免疫的機制是當今病毒學研究最重要的前沿領域之一。病毒感染宿主細胞時,細胞表達的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別和遞呈病毒的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),經一系列的信號轉導最終誘導Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)等細胞因子的表達。從感染細胞分泌的IFN-Ⅰ與細胞膜上IFN-Ⅰ共有的受體結合后,激活相

2、應的信號轉導,誘導其他抗病毒蛋白與免疫調節(jié)因子的表達,從而抑制病毒的復制與傳播,并激活獲得性免疫系統(tǒng)進一步清除入侵的病毒,在機體的抗病毒過程中起重要作用。
　　 盡管近年來的研究初步揭示了病毒感染誘導IFN-Ⅰ產生的過程,但仍有很多未知的問題有待進一步探討。例如,新發(fā)現(xiàn)的識別DNA和RNA的信號蛋白識別病毒并誘導IFN—Ⅰ的分子機制還不清楚,而細胞中是否還存在其它可以激活IFN-Ⅰ的蛋白,DNA病毒的識別受體及其介導IFN-Ⅰ產

3、生的機制是什么等等。因為具有低成本和高相似性等特點,豬的免疫系統(tǒng)逐漸成為人體免疫機制研究的模型。為了揭示病毒感染豬源細胞后誘導IFN-Ⅰ產生的分子機制,本研究從豬源細胞中克隆了2個參與天然免疫的重要細胞信號分子,并分別以偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)和豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)為DNA病毒和RNA病毒的模型對其感染細胞后的天然免疫反應

4、信號通路進行了研究。具體內容如下:
　　 1.豬DAI基因的克隆及其功能鑒定DAI(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors)是被發(fā)現(xiàn)的第一個介導細胞內dsDNA誘導天然免疫的受體蛋白,但研究發(fā)現(xiàn)DAI的作用可能存在細胞特異性和種屬特異性。為此根據(jù)與人DAI基因有較高同源性的豬基因組序列設計引物,以豬外周血單核細胞的RNA為模板克隆得到豬DAI全長cDNA。序列分析表明,

5、豬DAI開放閱讀框全長為1320bp(GenBank收錄號:FJ455510),編碼439個氨基酸。進一步對推導的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn),豬DAI基因編碼蛋白結構域和人、牛、鼠一樣,其N端都具有兩個DNA結合區(qū)。組織表達譜分析表明豬DAI mRNA主要表達于脾臟、肺臟、腎臟和小腸中。為了分析豬DAI是否能誘導Ⅰ型干擾素的產生,采用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)在不同豬源細胞中超表達豬DAI均能在不同程度上激活轉錄因子IRF3(interfer

6、on regulatory factor3)和NF-κB(nuclear factor-kappaB),并誘導IFN-β的產生,其DNA結合區(qū)和C端對激活IFN-β都是非常重要的。而通過RNA干擾技術把豬DAI沉默后則顯著抑制dsDNA和PRV誘導的IFN-β。這些結果提示DAI是豬天然免疫系統(tǒng)中的一個dsDNA的模式識別受體,在Ⅰ型干擾素誘導的信號通路中具有重要作用。
　　 2.豬STNG基因的克隆及其功能鑒定繼DAI后,國際

7、上三個研究小組幾乎同時報道了另一個參與細胞內dsDNA誘導IFN-Ⅰ表達的信號分子-STING(stimulator of interferon genes),但不同研究對STING的亞細胞定位及其在dsRNA和RNA病毒誘導IFN-Ⅰ中的作用存在著分歧。根據(jù)與人STING基因序列有較高同源性的豬EST序列進行拼接并設計引物,從豬外周血單核細胞中擴增并獲得豬STING全長cDNA。序列分析表明,豬STING開放閱讀框全長為1137bp(

8、GenBank收錄號:FJ455509),編碼378個氨基酸,含有1個內質網滯留序列。通過組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)豬STING主要表達于脾臟、淋巴結和肺臟中。結構預測表明豬STING含有4個跨膜區(qū),利用綠熒光蛋白做標記進行研究發(fā)現(xiàn)其主要定位于內質網,但也有部分定位于線粒體。超表達豬STING能有效激活轉錄因子IRF3和NF-κB,并誘導IFN-β的產生。利用RNAi下調豬STING的表達則抑制RNA病毒和DNA病毒在細胞中所誘導的IFN-β的

9、表達。這些結果提示STING是豬天然免疫系統(tǒng)中的一個重要的調節(jié)因子,為進一步闡明STING在天然免疫中的作用提供了依據(jù)。
　　 3.PRV誘導β干擾素產生的分子機制研究偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科,為雙鏈DNA病毒。以前的研究表明,PRV感染能有效誘導機體天然免疫。但是迄今為止對于PRV是否誘導β干擾素(IFN—β)的產生及其分子機制還不清楚。采用IFN-β啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細胞(porci

10、ne kidney cell line)后能顯著誘導IFN-β的產生,熒光定量RT-PCR檢測也得到了相似的結果。為了闡明PRV感染PK-15細胞激活IFN-β的分子機制,運用RNAi技術和顯性負調控突變體分別研究了胞內信號通路和TLR信號通路在PRV激活IFN-β中的作用。結果顯示PRV可通過TLR(Toll-like receptor)的接頭分子MyD88(myeloid differentiation factor-88)和胞內信

11、號分子RIG-Ⅰ(retinoic acid-induciblegeneⅠ)和VISA(virus—induced signaling adaptor)激活IFN-β。有趣的是,RNAi實驗表明PRV感染PK-15細胞誘導IFN-β的表達需要IRF1(interferon regulatory factor1)、IRF5(interferon regulatory factor5)和IRF7(interferon regulatory

12、factor7)參與,卻不需要IRF3。IRF3是干擾素調節(jié)因子(imerferon regulatory factors,IREs)家族中的重要轉錄因子之一,并且在很多病毒誘導的干擾素基因表達和抗病毒天然免疫反應中都具有重要作用。為了進一步驗證IRFs與PRV感染激活IFN-β產生的關系,將各個干擾素調節(jié)因子的負調控突變體轉染人胚胎腎細胞系(human embryonic kidney cell line,HEK293),然后用PRV

13、感染,結果證明PRV感染HEK293細胞激活IFN-β產生也不需要轉錄因子IRF3的參與。這些結果提示PRV通過一種獨特的機制調節(jié)天然免疫。但是,很多問題仍然未知,如PRV如何被信號分子識別以及具體的信號傳遞網絡等。對這些問題的研究將有助于進一步了解DNA病毒誘導的天然免疫機制。
　　 4.TGEV誘導β干擾素產生的分子機制研究豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬,為不分節(jié)段的單股.鏈RNA病毒。以前的研究表明

14、,TGEV誘導IFN-Ⅰ的表達。但是對其誘導IFN-Ⅰ產生的機制并不清楚。我們利用熒光素酶報告系統(tǒng)和熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)TGEV在PK-15細胞中能顯著激活IFN-β。進一步對TLR信號通路和胞內信號通路相關信號分子在TGEV誘導IFN-β中的作用的研究發(fā)現(xiàn),TGEV可通過TLR信號通路的接:分子MyD88誘導IFN-β,同時還依賴RIG-Ⅰ、MDA5(melanomadifferentiation-associated gene5)、ST

15、ING、HMGB1(High mobility group box1)、HMGB2(High mobility group box2)、IRF5和IRF7等胞內信號分子,但與TRIF(TIRdomain-containing adaptor inducing IFN-β)、IRF1及IRF3無關。對TGEV各結構蛋白誘導豬IFN-β啟動子能力的研究發(fā)現(xiàn),M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleocapsidprot