傳染性胃腸炎病毒基因組大片段克隆及其主要抗原片段在偽狂犬病病毒中的表達(dá).pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文傳染性胃腸炎病毒基因組大片段克隆及其主要抗原片段在偽狂犬病病毒中的表達(dá)姓名：殷華平申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：郭萬柱20070601分別與pGMT載體連接，結(jié)果僅成功克隆了其中的TGEVA、TGEVB、TGEVF三個(gè)片段，分別命名為pTA—A、pTA—B、pGMT。為了在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中進(jìn)行S基因主要抗原片段的表達(dá)，設(shè)計(jì)一對引物從TGEV細(xì)胞毒RNA中擴(kuò)增出了包含s基因主要抗原的片段，分別連接

2、pET32a()、pET28a()和pEGFPC1表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET32a—S、pET28aS、pEGFPCI一S，并在大場桿菌和Vero細(xì)胞中分別進(jìn)行了原核和真核的表達(dá)，結(jié)果pET32aS、pET28aS在EcoliBL21細(xì)胞中未能獲得良好表達(dá)，而pEGFPCIS在Vero細(xì)胞中成功地獲得了表達(dá)。為了構(gòu)建表達(dá)TGEVS基因主要抗原片段的PRV重組病毒，PCR擴(kuò)增了s基因主要抗原片段，并克隆到已經(jīng)構(gòu)建成功的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)移載

3、體pPPl2EGFP中，命名為pPPl2EGFPS，采用磷酸鈣法將pPPl2EGFPS與SA215病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，結(jié)果在12小時(shí)以后可以觀察到綠色熒光，24～48小時(shí)熒光到達(dá)最大量，48小時(shí)后熒光開始衰退，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后開始出現(xiàn)病變，96小時(shí)后細(xì)胞75％出現(xiàn)病變；在96小時(shí)后可以看見出現(xiàn)發(fā)生重組的綠色熒光病變細(xì)胞，挑取病灶反復(fù)純化幾次，獲得了表達(dá)s基因主要抗原片斷重組病毒PRVSA215S，抽提病毒基因組DNA

4、，PCR擴(kuò)增能夠從中擴(kuò)增出大小為17kb的S基因主要抗原片段。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析了PRY和TGEV全基醫(yī)序列的密碼子偏愛性，分別計(jì)算了其RSCU、Nc、Gc、GC囂、雙核苷酸組成，根據(jù)計(jì)算的結(jié)果運(yùn)用GGNc分布圖、Gc，z6C。。散點(diǎn)圖、對應(yīng)分析解析了TGEV和PRV密碼子用法發(fā)生偏愛的主要影響因素，結(jié)果表明，PRV主要偏愛于使用以G和C結(jié)尾的密碼子，而TGEV則主要使用以A和u結(jié)尾的密碼子，影響PRV密碼子偏愛G、C的主要因素是堿