DDAH1-ADMA-NOS信號通路參與METH神經(jīng)毒性的研究及L-257的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景:毒品濫用是全球各國都面臨的棘手的社會問題,特別是新型毒品種類不斷增多,為毒品的防治提出新的挑戰(zhàn)。我國的吸毒問題也日趨嚴(yán)峻,長期吸毒往往會造成吸毒者機體和精神兩方面的損害,并能傳播艾滋病、肝炎等多種疾病,嚴(yán)重影響個體身心健康。吸毒成癮者為籌措毒資所引發(fā)的刑事犯罪案件和社會治安事件也日益增多,對社會的穩(wěn)定造成極大危害。近年來,國際上關(guān)于新型毒品成癮及損傷機制方面的研究,已成為熱點課題。
　　 甲基苯丙胺(Methamphe

2、tamine,METH)屬于苯丙胺類興奮劑(amphetamine-type stimulants,ATS),又稱去氧麻黃素。近年來,METH的濫用人數(shù)不斷上升,全球濫用僅次于大麻,成為危害最為嚴(yán)重和廣泛的毒品之一。METH具有多種藥理、毒理學(xué)特性,特別是有很強的中樞興奮作用且易形成藥物依賴性,長期濫用可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)病理和行為的改變。對METH成癮者而言,毒品影響的不僅是精神,還包括神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷性改變。近年來

3、的研究顯示,METH有較強的神經(jīng)毒性,可導(dǎo)致大腦出現(xiàn)與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和帕金森病(Parkinson's disease,PD)等神經(jīng)退行性病變類似的病理學(xué)改變?，F(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示,這些可能的機制主要包括:氧化應(yīng)激損傷作用、體溫平衡失調(diào)、離子穩(wěn)態(tài)破壞以及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的激活等。但現(xiàn)有的研究結(jié)果仍不足以充分闡釋METH的神經(jīng)毒性機制,對其毒性作用尚缺乏有效的防治手段。
　　 我們在前

4、一階段的研究中,對METH注射后大鼠額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬等部位的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析,認(rèn)為氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、蛋白酶體功能失調(diào)以及凋亡等是參與METH神經(jīng)毒性的主要機制。其中,一種新型的一氧化氮(nitric oxide,NO)生成調(diào)節(jié)酶——二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(Nω,Nω-dimethyl—L-arginine dimethylaminohydrolase,DDAH1)在紋狀體和額葉皮質(zhì)的高表達(dá)尤其令人矚目。D

5、DAH是近年發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶,在體內(nèi)存在生物學(xué)活性相似的兩種亞型,其中DDAH1主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。DDAH主要參與不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylated L-arginine,ADMA)的分解代謝,體內(nèi)95％以上的ADMA均由DDAH分解代謝,使正常生理情況下不同的組織器官內(nèi)的ADMA濃度維持在相應(yīng)的水平。而ADMA是含有甲基化精氨酸蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物,蛋白質(zhì)甲基化是生物體內(nèi)普遍存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾

6、現(xiàn)象,蛋白質(zhì)的甲基化和甲基化蛋白質(zhì)的降解,是機體內(nèi)存在的正常生理過程。研究發(fā)現(xiàn),ADMA是內(nèi)源性的一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,NOS)的抑制劑,對三種亞型的NOS均有抑制作用。某種病理情況下體內(nèi)ADMA濃度下降,則可導(dǎo)致其對NOS的抑制作用減弱,組織內(nèi)NO合成增加?？梢?DDAH可以通過調(diào)節(jié)組織內(nèi)ADMA的降解率,調(diào)節(jié)組織中NOS的活性和NO的合成。正常生理條下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NO主要通過神經(jīng)型NOS(ni

7、tric oxide synthase,nNOS)產(chǎn)生,作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮生理作用并可調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的可塑性。而在氧化應(yīng)激等病理條件下,產(chǎn)生的過量NO,則有可能對組織造成損害。研究證明,氧化應(yīng)激及其過程中產(chǎn)生的NO,在衰老和AD等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制中起重要作用,NO和超氧陰離子的產(chǎn)物可造成腦組織DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷、功能喪失和死亡。
　　 越來越多的研究結(jié)果提示DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)可能是

8、NO過表達(dá)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷病理過程的重要調(diào)控機制。根據(jù)我們上一階段的研究結(jié)果,METH導(dǎo)致DDAH1在額葉皮質(zhì)和紋狀體表達(dá)增高,這些部位腦組織同時伴有NO的升高和神經(jīng)組織損傷,表明METH有可能通過DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)調(diào)控NO的合成產(chǎn)生相關(guān)的神經(jīng)毒性作用。目前,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中nNOS的調(diào)控機制尚未明了,研究DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)在METH神經(jīng)毒性機制中的作用,將為METH毒性的防治和其他相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的治療提

9、供新的思路和有效的藥物作用靶點。
　　 目的:建立單純METH急性中毒和經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型,運用病理學(xué)、行為學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方法,了解METH毒性作用及L-257預(yù)處理對METH毒性作用的影響；檢測L-257預(yù)處理大鼠腦組織中與METH毒性作用密切相關(guān)的氧化應(yīng)激DDAH1/ADMA/NOS信號通路分子的表達(dá)變化,探討DDAH1特異性抑制劑L-257是否能通過降低組織中DDAH1的含量及酶的活性

10、,而減輕METH的神經(jīng)毒性損傷。
　　 方法
　　 1.單純METH急性中毒和經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型的建立成年雄性SD大鼠,體重180～220g,隨機分為①單純METH組(A組)；②經(jīng)L-257預(yù)處理的METH組(B組)；③生理鹽水組(C組),每組20只。動物單只單籠飼養(yǎng)于空調(diào)恒溫動物房,自由飲水進(jìn)食,24小時正常晝夜節(jié)律,飼養(yǎng)適應(yīng)一周后開始實驗。
　　 1.1.單純METH急性中毒動物模型

11、的建立A組動物腹腔注射METH,劑量為15mg/kg體重,每天早8:00點、晚6:00點各注射一次,連續(xù)注射4天,共8次。注射后出現(xiàn)神經(jīng)毒性相關(guān)癥狀視為模型成功。
　　 1.2.L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型的建立B組動物實驗前一周進(jìn)行側(cè)腦室插管手術(shù)。實驗開始后每天早8:00點、晚6:00點經(jīng)插管向側(cè)腦室內(nèi)注射L-257一次,劑量為15mg/kg體重,連續(xù)注射4天,共8次。每次注射后間隔二小時腹腔注射METH,劑量為

12、15 mg/kg體重,亦為連續(xù)注射4天,共8次。動物對手術(shù)及側(cè)腦室內(nèi)留置管耐受良好,無異常反應(yīng),給予METH后出現(xiàn)與A組相似的神經(jīng)毒性表現(xiàn)視為模型成功。
　　 1.3.生理鹽水組的建立C組設(shè)為正常對照組,每天早8:00點、晚6:00點各腹腔注射一次生理鹽水,劑量為0.6ml,連續(xù)注射4天,共8次。
　　 以上所有動物實驗前均馴養(yǎng)一周。每日訓(xùn)練一次,每次1～5min,使大鼠習(xí)慣術(shù)者以后對其觸摸及進(jìn)行各種操作。
　　

13、 2.吸毒動物的行為學(xué)及病理學(xué)觀察每天早上給藥前記錄各組大鼠體重、進(jìn)食量、飲水量的變化,給藥后10min觀察動物的刻板行為改變并評分,末次腹腔注射后24h斷頭取腦組織進(jìn)行HE染色、Gless氏銀浸染觀察腦組織病理變化,并用TUNEL法進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測。
　　 3.單純METH中毒動物模型腦組織DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)表達(dá)變化、相關(guān)因素的檢測各組動物末次腹腔注射后24h斷頭取腦,參照大鼠腦立體定位圖譜,分離紋狀體、海

14、馬、額葉皮質(zhì)等三個腦區(qū)組織,采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR、Western Bolt方法檢測DDAH1在基因和蛋白水平的表達(dá)；ELISA法檢測ADMA含量；酶化學(xué)法檢測細(xì)胞nNOS活性、NO含量。
　　 4.經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物腦組織中DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)表達(dá)變化、相關(guān)因素的水平檢測和作用分析:方法同3。
　　 結(jié)果
　　 1.單純METH急性中毒動物模型和經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急

15、性中毒動物模型建模成功
　　 1.1.METH急性中毒動物模型建模成功METH注射后,A組動物進(jìn)食量減少,體重下降,同時出現(xiàn)明顯的行為改變,主要表現(xiàn)為好動、易激惹等。與C組相比上述指標(biāo)差異均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 1.2.L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型建模成功B組動物在METH注射后進(jìn)食量顯著減少,體重下降,同時出現(xiàn)明顯的行為改變,上述檢測指標(biāo)與A組相比無顯著性差異。與C組相比,B組動物上述指標(biāo)

16、差異均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.單純METH急性中毒動物和L-257預(yù)處理METH急性中毒動物腦組織的形態(tài)學(xué)改變
　　 2.1.單純METH急性中毒動物腦組織的形態(tài)學(xué)改變A組動物腹腔注射METH后,額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬等部位神經(jīng)細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞變圓,極性消失,細(xì)胞周圍水腫等形態(tài)學(xué)改變。Gless氏銀浸染發(fā)現(xiàn),A組動物三個腦區(qū)神經(jīng)軸索均呈現(xiàn)出扭曲、蛇行狀,有節(jié)段性增粗和軸索間隙增寬的表現(xiàn),且凋亡細(xì)胞比例明顯

17、增多。
　　 2.2.經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物腦組織的形態(tài)學(xué)改變B組動物在給予L-257后神經(jīng)細(xì)胞及軸索也出現(xiàn)與A組類似的改變,但與A組相比,程度明顯減輕。
　　 3.單純METH急性中毒動物腦組織中DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)表達(dá)變化、相關(guān)因素的檢測在額葉皮質(zhì)和紋狀體,A組動物DDAH1基因表達(dá)上調(diào),蛋白表達(dá)相應(yīng)增加,ADMA含量下降,與C組相比有顯著性差異(P<0.05)；在海馬區(qū),METH并不影

18、響DDAH1基因和蛋白的表達(dá),A組與C組相比無顯著性差異(P>0.05)。A、B組三個檢測腦區(qū)總NOS活性及NO的含量均顯著高于C組(P<0.05)。
　　 4.經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物腦組織中DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)表達(dá)變化、相關(guān)因素的檢測B組三個檢測腦區(qū)DDAH1基因及蛋白的表達(dá)顯著低于A組(P<0.05),同時ADMA含量較A組顯著升高(P<0.05),NOS活性及NO的含量均顯著低于A組(P<0.

19、05),但尚未達(dá)到C組水平,B組與C組比較,有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.單純METH急性中毒組動物出現(xiàn)明顯的METH所致神經(jīng)毒性表現(xiàn),說明METH急性中毒動物模型建立成功。
　　 2.L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型建立后大鼠對腦室內(nèi)插管耐受好,表現(xiàn)出與單純METH急性中毒動物相似的病理和行為學(xué)改變,說明L-257預(yù)處理的METH急性中毒動物模型建立成功。
　　 3.

20、METH具有明顯的神經(jīng)毒性作用,可造成大鼠額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬等多腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和軸索的損傷,引起細(xì)胞凋亡,中毒動物出現(xiàn)明顯的行為改變。
　　 4.經(jīng)過對METH急性中毒動物DDAH1/ADMA/NOS的觀察和相關(guān)因素的檢測,發(fā)現(xiàn)METH導(dǎo)致腦組織中DDAH1的含量增加、ADMA濃度降低,腦組織NOS活性增高,以及NO的過量生成。認(rèn)為DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)的上述改變,是METH神經(jīng)毒性作用的重要機制之一。