MAPKs、Nrf2與NF-κB信號通路在丙烯酰胺神經毒性中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分 ACR側腦室注射對大鼠紋狀體與小腦的毒性研究
　　目的：以病理學改變?yōu)橛^測指標，采用側腦室注射染毒方式，探討ACR對紋狀體與小腦MAPKs信號通路、Nrf2及NF-κB轉錄因子的影響。
　　方法：35只成年雄性SD大鼠，體重200 g～220 g，隨機分為5組，每組7只，即溶劑對照組（人工腦脊液，ACSF），6-羥基多巴胺（6-OHDA）（0.5 mg/kg）陽性對照組和ACR低、中、高（0.5、2.5、12.5

2、mg/kg）劑量組。側腦室雙側注射后，觀察動物一般行為改變。染毒24 h后處死動物，冰上立即分離紋狀體與小腦，-80℃保存?zhèn)溆?。尼氏染色觀察紋狀體與小腦神經元病理改變，免疫組織化學觀察酪氨酸羥化酶陽性（TH+）細胞數(shù)，Western blot法檢測TH蛋白表達，TUNEL法檢測神經元凋亡，分光光度計法測定MDA水平，酶標法測定GSH含量，ELISA法測定TNF-α、IL-6水平，Western blot法檢測MAPKs各蛋白表達，免疫熒

3、光技術觀察Nrf2與NF-κB轉錄因子表達。
　　結果：（1）一般行為改變：染毒次日，高劑量及陽性對照組動物出現(xiàn)輕度步態(tài)紊亂現(xiàn)象。（2）Nissl染色：與溶劑對照組相比，中、高劑量及陽性對照組紋狀體神經元與小腦蒲肯野細胞層尼氏體減少、細胞腫脹、排列疏松紊亂。（3） TH表達：與溶劑對照組比較，免疫組化結果顯示高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TH+細胞數(shù)均減少（P<0.05）；Western blot結果表明ACR各劑量與陽性對照組紋

4、狀體TH蛋白水平均降低（P<0.01），高劑量與陽性對照組小腦TH蛋白表達亦減少（P<0.01）。（4）神經元凋亡：高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TUNEL陽性細胞數(shù)目較溶劑對照組顯著上升（P<0.05）。（5）氧化應激與炎性反應：與溶劑對照組相比，中劑量組紋狀體與高劑量組小腦MDA含量顯著升高（P<0.05）；ACR各劑量及陽性對照組紋狀體與小腦 GSH含量顯著降低（P<0.01）。與溶劑對照組相比，紋狀體內 TNF-α含量在高劑量與

5、陽性對照組顯著增加（P<0.05），IL-6僅在中劑量組明顯升高（P<0.05）；小腦內TNF-α含量在高劑量組顯著升高（P<0.05），IL-6含量在高劑量及陽性對照組顯著上升（P<0.01）。（6）MAPKs信號通路：與溶劑對照組比較，小腦內高劑量組p-ERK1/2，陽性對照組p-JNK1/2，中、高劑量與陽性對照組p-p38蛋白表達均顯著升高（P<0.05）；紋狀體內陽性對照組 p-ERK1/2、高劑量組 p-JNK1/2、中劑量

6、組 p-p38蛋白表達均顯著增加（P<0.05）。（7）Nrf2轉錄因子：免疫熒光結果顯示與溶劑對照組比較，高劑量與陽性對照組紋狀體 Nrf2表達顯著上升（P<0.05）；中、高劑量組小腦Nrf2表達亦顯著增加（P<0.01）。（8）NF-κB轉錄因子：免疫熒光結果顯示與溶劑對照組比較，中、高劑量及陽性對照組紋狀體 NF-κB表達均顯著增加（P<0.05）；高劑量與陽性對照組小腦NF-κB表達顯著升高（P<0.01）。
　　結論：

7、本研究建立ACR側腦室注射神經毒性動物模型，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg ACR側腦室注射未引起紋狀體與小腦神經元病理改變；2.5 mg/kg ACR側腦室注射均可致紋狀體與小腦神經元病理改變及多巴胺能神經元數(shù)目減少；12.5 mg/kg ACR染毒除引起上述改變外，還誘導紋狀體與小腦神經元凋亡，大鼠出現(xiàn)輕微步態(tài)改變。此外，ACR可誘導紋狀體與小腦氧化應激與細胞炎性因子水平增加，激活MAPKs信號通路，促進Nrf2及NF-κB轉錄因子表達增加

8、。
　　第二部分 ACR對PC12細胞的毒性作用及分子機制研究
　　目的：以細胞活力、氧化應激及炎性反應作為觀測指標，觀察ACR對PC12細胞的毒性效應。通過特異性抑制劑與siRNA轉染技術，探討ACR細胞毒性中MAPKs、Nrf2與NF-κB信號通路的激活及三條通路之間的cross-talk，以此闡明ACR毒性作用的分子機制。
　　方法：細胞染毒：0.6、1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理PC12細胞12

9、 h或24 h。抑制劑或細胞轉染：抑制劑（10μmol/L U0126、20μmol/L SP600125、10μmol/L SB202190、5μmol/L BAY11-7082）分別預處理細胞2 h或細胞轉染（20 nmol/L control siRNA或Nrf2 siRNA）4 h后，2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。MTT法檢測細胞活力，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，DCFH-DA熒光探針法檢測ROS生成，分光光度計測定M

10、DA含量，酶標法測定GSH水平與GSH-Px活力，ELISA法檢測細胞因子TNF-α、IL-6水平，免疫熒光檢測Nrf2與NF-κB核轉位，Western blot測定胞漿胞核Nrf2、keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達，以及胞漿胞核NF-κB、IκBα、TNF-α、COX-2蛋白表達，RT-PCR檢測HO-1、NQO-1、TNF-α、IL-6的mRNA表達。
　　結果：（1）細胞活力：與對照組相比，在不同劑量ACR暴露12

11、 h后細胞活力均未發(fā)生顯著性改變。2.5、5 mmol/L ACR暴露24 h可致細胞數(shù)目減少，神經突收縮，貼壁能力降低，胞體呈球狀，且細胞活力顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)較好的時間-劑量效應關系。
　　（2）氧化應激與炎性反應：與對照組相比，2.5、5 mmol/L ACR組細胞ROS與MDA水平均顯著增加（P<0.05），GSH含量在1.25、2.5、5 mmol/L ACR組顯著降低（P<0.05）；TNF-α含量及mRN

12、A水平在2.5、5 mmol/L ACR作用后顯著增加（P<0.05），IL-6含量及mRNA水平僅在5 mmol/L ACR作用下顯著升高（P<0.01）。提示ACR可引起細胞氧化應激與炎性反應。
　　（3）MAPKs信號通路：2.5、5 mmol/L ACR可使p-JNK1/2與p-p38蛋白表達較對照組顯著增加（P<0.05）。提示ACR可激活JNK與p38通路，且具有劑量效應關系。抑制劑試驗表明，較2.5 mmol/L A

13、CR組，MEK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB202190分別預處理均致Nrf2與NF-κB蛋白表達顯著降低（P<0.05），并減少Nrf2與NF-κB通路下游靶基因HO-1、NQO-1、TNF-α的mRNA表達（P<0.05）。提示MAPKs通路阻斷可抑制ACR誘導的Nrf2與NF-κB通路的活化。
　?。?）Nrf2信號通路：免疫熒光結果表明ACR各劑量組Nrf2出現(xiàn)核轉位現(xiàn)象，Western

14、blot結果表明ACR各劑量組胞核Nrf2蛋白水平較對照組顯著增加（P<0.01）；伴侶蛋白keap1蛋白表達較對照組在5 mmol/L ACR作用下顯著升高（P<0.01）；Nrf2通路下游調控因子HO-1蛋白水平在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升（P<0.05），NQO-1蛋白表達在1.25、2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組亦顯著增加（P<0.05）。提示ACR可誘導Nrf2信號通路

15、的活化，且具有劑量效應關系。RNA干擾試驗顯示，與siRNA對照組比較，Nrf2 siRNA轉染細胞內NF-κB蛋白水平顯著降低（P<0.01）。提示Nrf2基因沉默可抑制ACR誘導的NF-κB轉錄因子活化。
　?。?）NF-κB信號通路：免疫熒光結果顯示2.5、5 mmol/L ACR組NF-κB出現(xiàn)核轉位現(xiàn)象，Western blot結果顯示胞核NF-κB蛋白表達在1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理后較對照組顯著升

16、高（P<0.05）；伴侶蛋白IκBα蛋白表達在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著升高（P<0.05）；NF-κB通路下游調控因子TNF-α、COX-2蛋白水平均在2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升（P<0.05）。提示ACR可活化NF-κB信號通路，且具有劑量效應關系。抑制劑試驗表明，較2.5 mmol/L ACR組，NF-κB通路抑制劑BAY11-7082預處理可致Nrf2蛋白水平顯著

17、降低（P<0.01）。提示NF-κB通路阻斷可抑制ACR誘導的Nrf2轉錄因子活化。
　　結論： ACR在2.5、5 mmol/L劑量下作用24 h呈現(xiàn)出明顯的細胞毒性，且具有劑量效應關系，表現(xiàn)為細胞活力降低、氧化應激及炎性反應發(fā)生。其可能涉及的分子機制包括 ACR激活 MAPKs信號通路（JNK、p38通路）；ACR促進keap1-Nrf2解離與核轉位，促使靶基因HO-1、NQO-1蛋白表達增加；ACR引起IκBα-NF-κB解

18、離與核轉位，上調下游基因 TNF-α、COX-2蛋白表達。在 ACR細胞毒性中，MAPKs、Nrf2與NF-κB之間存在cross-talk，表現(xiàn)為MAPKs通路對Nrf2與NF-κB具有調控作用，而Nrf2與NF-κB之間存在雙向調節(jié)效應。
　　第三部分 JNK與p38對ACR致PC12細胞凋亡的調控機制研究
　　目的：以細胞凋亡為觀測終點，探討線粒體凋亡通路是否參與ACR誘導的PC12細胞凋亡。采用特異性阻斷劑研究JNK

19、與p38信號通路對線粒體介導凋亡的調控作用，為尋找ACR中毒的防治靶點提供理論依據(jù)。
　　方法：細胞染毒：0.6、1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理細胞24 h。抑制劑：U0126、SP600125、SB202190分別預處理2 h后，2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。Hoechst33258染色觀察細胞凋亡，透射電鏡觀察細胞與線粒體超微結構，流式細胞術測定細胞凋亡率，JC-1染色檢測線粒體膜電位改變，Wes

20、tern blot檢測Bcl-2、Bax、細胞色素c、caspase-9與caspase-3蛋白表達。
　　結果：（1）細胞凋亡：2.5、5 mmol/L ACR作用使DNA裂解，細胞核異染色體聚集；與對照組比較，2.5、5 mmol/L ACR處理可致細胞早期與晚期凋亡率均顯著升高（P<0.05）。（2）線粒體膜電位與超微結構改變：與對照組比較，2.5、5 mmol/L ACR處理可致線粒體膜電位顯著降低（P<0.01）；2.5

21、 mmol/L ACR作用可使線粒體腫脹，甚至嵴斷裂。（3）線粒體凋亡途徑相關蛋白表達：與對照組相比，1.25、2.5、5 mmol/L ACR均可致Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05），Bax蛋白水平在2.5、5 mmol/L ACR作用下顯著增加（P<0.05），細胞色素c蛋白表達在0.6、1.25、2.5 mmol/LACR作用下均顯著升高（P<0.01）。（4）caspase級聯(lián)反應：與對照組相比，2.5、5 mmol/L

22、 ACR作用可致caspase-9、caspase-3酶原顯著降低（P<0.05），caspase-9、caspase-3活化片段顯著增加（P<0.01）。（5） JNK與p38通路對線粒體介導凋亡的調節(jié)：與ACR組相比，ACR+SP600125組Bcl-2蛋白表達升高（P<0.05），Bax與細胞色素c蛋白水平降低（P<0.01），線粒體膜電位顯著升高（P<0.01），細胞早期與晚期凋亡率均顯著減少（P<0.05）；較ACR組，ACR

23、+SB202190組僅Bcl-2蛋白表達增加（P<0.05），且細胞早期凋亡減少（P<0.05）。提示JNK與p38通路阻斷均可通過調節(jié)線粒體凋亡通路降低ACR誘導的PC12細胞凋亡，其中JNK通路阻斷對ACR誘導的凋亡的抑制更明顯。
　　結論：ACR在2.5、5 mmol/L劑量下處理24 h可致PC12細胞線粒體超微結構異常及線粒體膜電位降低，啟動線粒體凋亡通路，激活caspase級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡。JNK與p38對線