MAPKs、Nrf2與NF-κB信號通路在丙烯酰胺神經(jīng)毒性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 ACR側(cè)腦室注射對大鼠紋狀體與小腦的毒性研究
　　目的：以病理學(xué)改變?yōu)橛^測指標(biāo)，采用側(cè)腦室注射染毒方式，探討ACR對紋狀體與小腦MAPKs信號通路、Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的影響。
　　方法：35只成年雄性SD大鼠，體重200 g～220 g，隨機(jī)分為5組，每組7只，即溶劑對照組（人工腦脊液，ACSF），6-羥基多巴胺（6-OHDA）（0.5 mg/kg）陽性對照組和ACR低、中、高（0.5、2.5、12.5

2、mg/kg）劑量組。側(cè)腦室雙側(cè)注射后，觀察動(dòng)物一般行為改變。染毒24 h后處死動(dòng)物，冰上立即分離紋狀體與小腦，-80℃保存?zhèn)溆?。尼氏染色觀察紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變，免疫組織化學(xué)觀察酪氨酸羥化酶陽性（TH+）細(xì)胞數(shù)，Western blot法檢測TH蛋白表達(dá)，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡，分光光度計(jì)法測定MDA水平，酶標(biāo)法測定GSH含量，ELISA法測定TNF-α、IL-6水平，Western blot法檢測MAPKs各蛋白表達(dá)，免疫熒

3、光技術(shù)觀察Nrf2與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）一般行為改變：染毒次日，高劑量及陽性對照組動(dòng)物出現(xiàn)輕度步態(tài)紊亂現(xiàn)象。（2）Nissl染色：與溶劑對照組相比，中、高劑量及陽性對照組紋狀體神經(jīng)元與小腦蒲肯野細(xì)胞層尼氏體減少、細(xì)胞腫脹、排列疏松紊亂。（3） TH表達(dá)：與溶劑對照組比較，免疫組化結(jié)果顯示高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TH+細(xì)胞數(shù)均減少（P<0.05）；Western blot結(jié)果表明ACR各劑量與陽性對照組紋

4、狀體TH蛋白水平均降低（P<0.01），高劑量與陽性對照組小腦TH蛋白表達(dá)亦減少（P<0.01）。（4）神經(jīng)元凋亡：高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目較溶劑對照組顯著上升（P<0.05）。（5）氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)：與溶劑對照組相比，中劑量組紋狀體與高劑量組小腦MDA含量顯著升高（P<0.05）；ACR各劑量及陽性對照組紋狀體與小腦 GSH含量顯著降低（P<0.01）。與溶劑對照組相比，紋狀體內(nèi) TNF-α含量在高劑量與

5、陽性對照組顯著增加（P<0.05），IL-6僅在中劑量組明顯升高（P<0.05）；小腦內(nèi)TNF-α含量在高劑量組顯著升高（P<0.05），IL-6含量在高劑量及陽性對照組顯著上升（P<0.01）。（6）MAPKs信號通路：與溶劑對照組比較，小腦內(nèi)高劑量組p-ERK1/2，陽性對照組p-JNK1/2，中、高劑量與陽性對照組p-p38蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05）；紋狀體內(nèi)陽性對照組 p-ERK1/2、高劑量組 p-JNK1/2、中劑量

6、組 p-p38蛋白表達(dá)均顯著增加（P<0.05）。（7）Nrf2轉(zhuǎn)錄因子：免疫熒光結(jié)果顯示與溶劑對照組比較，高劑量與陽性對照組紋狀體 Nrf2表達(dá)顯著上升（P<0.05）；中、高劑量組小腦Nrf2表達(dá)亦顯著增加（P<0.01）。（8）NF-κB轉(zhuǎn)錄因子：免疫熒光結(jié)果顯示與溶劑對照組比較，中、高劑量及陽性對照組紋狀體 NF-κB表達(dá)均顯著增加（P<0.05）；高劑量與陽性對照組小腦NF-κB表達(dá)顯著升高（P<0.01）。
　　結(jié)論：

7、本研究建立ACR側(cè)腦室注射神經(jīng)毒性動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg ACR側(cè)腦室注射未引起紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變；2.5 mg/kg ACR側(cè)腦室注射均可致紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變及多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少；12.5 mg/kg ACR染毒除引起上述改變外，還誘導(dǎo)紋狀體與小腦神經(jīng)元凋亡，大鼠出現(xiàn)輕微步態(tài)改變。此外，ACR可誘導(dǎo)紋狀體與小腦氧化應(yīng)激與細(xì)胞炎性因子水平增加，激活MAPKs信號通路，促進(jìn)Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加

8、。
　　第二部分 ACR對PC12細(xì)胞的毒性作用及分子機(jī)制研究
　　目的：以細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)作為觀測指標(biāo)，觀察ACR對PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng)。通過特異性抑制劑與siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，探討ACR細(xì)胞毒性中MAPKs、Nrf2與NF-κB信號通路的激活及三條通路之間的cross-talk，以此闡明ACR毒性作用的分子機(jī)制。
　　方法：細(xì)胞染毒：0.6、1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理PC12細(xì)胞12

9、 h或24 h。抑制劑或細(xì)胞轉(zhuǎn)染：抑制劑（10μmol/L U0126、20μmol/L SP600125、10μmol/L SB202190、5μmol/L BAY11-7082）分別預(yù)處理細(xì)胞2 h或細(xì)胞轉(zhuǎn)染（20 nmol/L control siRNA或Nrf2 siRNA）4 h后，2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，DCFH-DA熒光探針法檢測ROS生成，分光光度計(jì)測定M

10、DA含量，酶標(biāo)法測定GSH水平與GSH-Px活力，ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平，免疫熒光檢測Nrf2與NF-κB核轉(zhuǎn)位，Western blot測定胞漿胞核Nrf2、keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)，以及胞漿胞核NF-κB、IκBα、TNF-α、COX-2蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測HO-1、NQO-1、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞活力：與對照組相比，在不同劑量ACR暴露12

11、 h后細(xì)胞活力均未發(fā)生顯著性改變。2.5、5 mmol/L ACR暴露24 h可致細(xì)胞數(shù)目減少，神經(jīng)突收縮，貼壁能力降低，胞體呈球狀，且細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)較好的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　（2）氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)：與對照組相比，2.5、5 mmol/L ACR組細(xì)胞ROS與MDA水平均顯著增加（P<0.05），GSH含量在1.25、2.5、5 mmol/L ACR組顯著降低（P<0.05）；TNF-α含量及mRN

12、A水平在2.5、5 mmol/L ACR作用后顯著增加（P<0.05），IL-6含量及mRNA水平僅在5 mmol/L ACR作用下顯著升高（P<0.01）。提示ACR可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)。
　?。?）MAPKs信號通路：2.5、5 mmol/L ACR可使p-JNK1/2與p-p38蛋白表達(dá)較對照組顯著增加（P<0.05）。提示ACR可激活JNK與p38通路，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。抑制劑試驗(yàn)表明，較2.5 mmol/L A

13、CR組，MEK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB202190分別預(yù)處理均致Nrf2與NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），并減少Nrf2與NF-κB通路下游靶基因HO-1、NQO-1、TNF-α的mRNA表達(dá)（P<0.05）。提示MAPKs通路阻斷可抑制ACR誘導(dǎo)的Nrf2與NF-κB通路的活化。
　?。?）Nrf2信號通路：免疫熒光結(jié)果表明ACR各劑量組Nrf2出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Western

14、blot結(jié)果表明ACR各劑量組胞核Nrf2蛋白水平較對照組顯著增加（P<0.01）；伴侶蛋白keap1蛋白表達(dá)較對照組在5 mmol/L ACR作用下顯著升高（P<0.01）；Nrf2通路下游調(diào)控因子HO-1蛋白水平在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升（P<0.05），NQO-1蛋白表達(dá)在1.25、2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組亦顯著增加（P<0.05）。提示ACR可誘導(dǎo)Nrf2信號通路

15、的活化，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。RNA干擾試驗(yàn)顯示，與siRNA對照組比較，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白水平顯著降低（P<0.01）。提示Nrf2基因沉默可抑制ACR誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活化。
　?。?）NF-κB信號通路：免疫熒光結(jié)果顯示2.5、5 mmol/L ACR組NF-κB出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Western blot結(jié)果顯示胞核NF-κB蛋白表達(dá)在1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理后較對照組顯著升

16、高（P<0.05）；伴侶蛋白IκBα蛋白表達(dá)在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著升高（P<0.05）；NF-κB通路下游調(diào)控因子TNF-α、COX-2蛋白水平均在2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升（P<0.05）。提示ACR可活化NF-κB信號通路，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。抑制劑試驗(yàn)表明，較2.5 mmol/L ACR組，NF-κB通路抑制劑BAY11-7082預(yù)處理可致Nrf2蛋白水平顯著

17、降低（P<0.01）。提示NF-κB通路阻斷可抑制ACR誘導(dǎo)的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子活化。
　　結(jié)論： ACR在2.5、5 mmol/L劑量下作用24 h呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)發(fā)生。其可能涉及的分子機(jī)制包括 ACR激活 MAPKs信號通路（JNK、p38通路）；ACR促進(jìn)keap1-Nrf2解離與核轉(zhuǎn)位，促使靶基因HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)增加；ACR引起IκBα-NF-κB解

18、離與核轉(zhuǎn)位，上調(diào)下游基因 TNF-α、COX-2蛋白表達(dá)。在 ACR細(xì)胞毒性中，MAPKs、Nrf2與NF-κB之間存在cross-talk，表現(xiàn)為MAPKs通路對Nrf2與NF-κB具有調(diào)控作用，而Nrf2與NF-κB之間存在雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　第三部分 JNK與p38對ACR致PC12細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究
　　目的：以細(xì)胞凋亡為觀測終點(diǎn)，探討線粒體凋亡通路是否參與ACR誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。采用特異性阻斷劑研究JNK

19、與p38信號通路對線粒體介導(dǎo)凋亡的調(diào)控作用，為尋找ACR中毒的防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：細(xì)胞染毒：0.6、1.25、2.5、5 mmol/L ACR處理細(xì)胞24 h。抑制劑：U0126、SP600125、SB202190分別預(yù)處理2 h后，2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡，透射電鏡觀察細(xì)胞與線粒體超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率，JC-1染色檢測線粒體膜電位改變，Wes

20、tern blot檢測Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c、caspase-9與caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞凋亡：2.5、5 mmol/L ACR作用使DNA裂解，細(xì)胞核異染色體聚集；與對照組比較，2.5、5 mmol/L ACR處理可致細(xì)胞早期與晚期凋亡率均顯著升高（P<0.05）。（2）線粒體膜電位與超微結(jié)構(gòu)改變：與對照組比較，2.5、5 mmol/L ACR處理可致線粒體膜電位顯著降低（P<0.01）；2.5

21、 mmol/L ACR作用可使線粒體腫脹，甚至嵴斷裂。（3）線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)：與對照組相比，1.25、2.5、5 mmol/L ACR均可致Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bax蛋白水平在2.5、5 mmol/L ACR作用下顯著增加（P<0.05），細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)在0.6、1.25、2.5 mmol/LACR作用下均顯著升高（P<0.01）。（4）caspase級聯(lián)反應(yīng)：與對照組相比，2.5、5 mmol/L

22、 ACR作用可致caspase-9、caspase-3酶原顯著降低（P<0.05），caspase-9、caspase-3活化片段顯著增加（P<0.01）。（5） JNK與p38通路對線粒體介導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)：與ACR組相比，ACR+SP600125組Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P<0.05），Bax與細(xì)胞色素c蛋白水平降低（P<0.01），線粒體膜電位顯著升高（P<0.01），細(xì)胞早期與晚期凋亡率均顯著減少（P<0.05）；較ACR組，ACR

23、+SB202190組僅Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P<0.05），且細(xì)胞早期凋亡減少（P<0.05）。提示JNK與p38通路阻斷均可通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路降低ACR誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，其中JNK通路阻斷對ACR誘導(dǎo)的凋亡的抑制更明顯。
　　結(jié)論：ACR在2.5、5 mmol/L劑量下處理24 h可致PC12細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)異常及線粒體膜電位降低，啟動(dòng)線粒體凋亡通路，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JNK與p38對線