NOS抑制物ADMA對急性卒中預(yù)后的評估及神經(jīng)保護的可能機制.pdf

1、非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是內(nèi)源性非選擇性一氧化氮合酶（nitric oxygen sythase，NOS）抑制劑，存在于人體內(nèi)所有有核細胞中，可抑制體內(nèi)一氧化氮(nitric oxygen，NO)的合成。ADMA可抑制內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)的活性，導(dǎo)致外周血管舒張功能受損，腦血流灌注下降，可能影響缺血性卒中患者的康復(fù);然而，針對ADMA抑制

2、神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)及誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)的活性，ADMA則抑制了由nNOS及iNOS介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，推測卒中后ADMA可能具有神經(jīng)保護作用。那么，作為一個整體，ADMA通過影響不同NOS的作用，最終對卒中患者預(yù)后有何影響，從臨床到機制的研究尚無定論，尤其是卒中患者體內(nèi)ADMA與卒中預(yù)后之間有無相關(guān)性，既往未見類似的研究。本研究通過臨床隊列與相應(yīng)的細胞模型探索ADMA與

3、缺血性卒中的相關(guān)性以及可能的機制:1、建立超急性期缺血性卒中患者隊列，檢測其外周血ADMA濃度，并隨訪卒中后90 d的改良Rankin評分(modified Rankin Scale，mRS)，了解卒中后外周血ADMA濃度與卒中預(yù)后的相關(guān)性;2、通過體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元細胞，建立糖氧剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)模型模擬體內(nèi)缺血性卒中過程，探討ADMA對OGD后神經(jīng)元細胞的保護作用來間接了解缺血性卒中發(fā)

4、生后神經(jīng)元細胞周圍的ADMA對神經(jīng)元細胞的保護作用;3、通過大鼠神經(jīng)元OGD模型初步探討ADMA對OGD后神經(jīng)元細胞保護作用的機制。
　　第一部分急性缺血性卒中患者外周血ADMA水平與卒中預(yù)后相關(guān)性研究
　　目的了解缺血性卒中患者超急性期外周血ADMA水平的變化趨勢及其與卒中預(yù)后的相關(guān)性;了解缺血性卒中超急性期外周血ADMA濃度與炎癥水平的相關(guān)性。我們還分析了ADMA的同系物對稱性二甲基精氨酸(symmetricdimeth

5、ylarginine，SDMA)及精氨酸（arginine，Arg）與卒中預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法本研究中共入組67例急性缺血性卒中患者及32例健康對照。所有病例均為發(fā)病6h以內(nèi)的缺血性卒中患者，伴有頭顱CT或MRI等影像學(xué)上明確的與本次發(fā)病部位對應(yīng)位置的缺血灶;排除標準包括:一過性腦缺血發(fā)作(transientischemic attack，TIA)、腦出血、惡性腫瘤、伴發(fā)嚴重感染性疾病、系統(tǒng)性風(fēng)濕性疾病。健康對照組來源于卒中患

6、者的健康家屬。采集所有患者卒中起病后6h、12h、24 h、3d及7d的外周血標本。外周血ADMA、SDMA及Arg濃度采用高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)方法進行檢測。外周血炎癥指標單核細胞趨附因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases，MMP-9)及組織型金屬機制蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitorof matr

7、ix metalloproteinase-1，TIMP-1)采用ELISA方法檢測。高敏CRP(highsensitive C-reactive protein，hsCRP)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)通過比濁法進行檢測。預(yù)后評價指標為卒中后90 d的mRS評分，mRS0-1分為良好預(yù)后，mRS2-6分為不良預(yù)后。卒中后不同時間點ADMA、SDMA及Arg濃度的差別采用repeated measurement統(tǒng)計

8、方法進行統(tǒng)計。ADMA濃度與卒中預(yù)后相關(guān)性采用多元回歸分析方法。外周血ADMA濃度與炎癥指標之間的相關(guān)性采用Pearson或Spearman相關(guān)分析。
　　結(jié)果缺血性卒中超急性期各研究時間點外周血ADMA濃度均明顯高于健康對照組，p＜0.05;而SDMA及Arg濃度與健康對照組相比無明顯差異。急性卒中患者超急性期外周血ADMA及SDMA濃度均隨時間推移升高，ADMA在卒中后3d達高峰，此后開始下降;SDMA濃度則在卒中后24 h內(nèi)

9、迅速上升，直至3d維持在較高水平。雖然卒中后外周血Arg濃度下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。血漿ADMA濃度變化時間曲線與卒中嚴重程度相關(guān)。中度及重度卒中外周血ADMA濃度在卒中后7d仍保持在較高水平，而輕度卒中外周血ADMA濃度3d達高峰，7d即可見明顯下降(p=0.048)。卒中后24 h SDMA濃度≥0.591 umol/L，卒中后3dADMA濃度≥0.566 umol/L及7 d ADMA濃度≥0.530 umol/L均提示缺血性卒

10、中患者卒中后90 d預(yù)后不良。卒中后24 h外周血SDMA濃度與MMP-9正相關(guān)，卒中后3d外周血ADMA濃度與IL-6及hsCRP等急性時相蛋白呈正相關(guān)，卒中后7 d ADMA濃度除了與IL-6及hsCRP呈正相關(guān)外，還與MCP-1及TIMP-1呈正相關(guān)。
　　結(jié)論缺血性卒中超急性期外周血ADMA及SDMA濃度可作為提示卒中預(yù)后的生物化學(xué)指標。卒中后外周血ADMA及SDMA的表達與炎癥水平相關(guān)。
　　第二部分 ADMA神經(jīng)

11、保護作用的研究
　　目的研究ADMA對OGD缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的影響，探討ADMA對OGD后神經(jīng)元細胞內(nèi)NO水平的影響。
　　方法取體外培養(yǎng)7d的大鼠神經(jīng)元細胞，隨機分成對照組、OGD組、不同濃度ADMA(3-300 uM)干預(yù)OGD組。根據(jù)實驗分組，對照組不給予任何干預(yù)措施;OGD組給予OGD干預(yù)1.5 h后復(fù)氧0-24 h;不同濃度ADMA干預(yù)OGD組為在OGD前24 h分別給予3 uM、10 uM、30 uM、10

12、0 uM及300 uM的ADMA預(yù)處理，并且在OGD及復(fù)氧2h過程中保持ADMA濃度不變。神經(jīng)元損傷評價方法:1.神經(jīng)元細胞免疫組化染色觀察神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)變化;2.測定細胞上清液中LDH含量評價神經(jīng)元損傷程度。細胞內(nèi)NO水平檢測采用NO檢測熒光探針DAF-FM DA，在熒光酶標儀上激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長515nm處檢測細胞內(nèi)熒光探針的相對熒光單位(relative fluorescent unit，RFU)，計算細胞內(nèi)NO的相

13、對含量。
　　結(jié)果與對照組相比，OGD缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)神經(jīng)元LDH釋放率為時間依賴性升高。OGD缺氧復(fù)氧后神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生變化:神經(jīng)元胞體腫脹或皺縮，神經(jīng)元軸突斷裂，部分可見軸突呈串珠樣改變，甚至軸突消失。ADMA干預(yù)OGD組神經(jīng)元LDH釋放率顯著低于OGD組(p＜0.01)，但是下降程度無ADMA濃度依賴關(guān)系。神經(jīng)元細胞免疫組化結(jié)果:與OGD組相比，30 uM ADMA干預(yù)OGD組神經(jīng)元形態(tài)保持相對完整。與對照組相比，OGD組細胞內(nèi)N

14、O水平升高(p＜0.05);30 uMADMA干預(yù)OGD組復(fù)氧0-24 h，多數(shù)觀察時間點神經(jīng)元細胞內(nèi)的NO水平與OGD組無顯著差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論 ADMA可減少OGD缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)保護作用，這種保護作用不依賴于ADMA對神經(jīng)元NO水平的抑制作用。
　　第三部分 ADMA神經(jīng)保護作用可能機制初步探討
　　目的研究縫隙連接蛋白-36（connexin36，cx36）在OGD缺氧復(fù)氧過程中

15、表達的變化，初步探討cx36在ADMA神經(jīng)保護過程中的作用。
　　方法取體外培養(yǎng)7d的大鼠神經(jīng)元細胞，隨機分成對照組、OGD組、及ADMA干預(yù)OGD組。對照組不給予任何特殊干預(yù);OGD組給予OGD1.5 h后復(fù)氧0-24 h;ADMA干預(yù)OGD組為OGD處理前24 h給予30 uM ADMA干預(yù)，并在之后的實驗過程中保持該濃度不變。采用Western blot方法檢測不同處理組神經(jīng)元細胞cx36的表達情況。采用熒光黃染料負荷實驗評

16、估各組神經(jīng)元細胞的縫隙連接介導(dǎo)的細胞通訊（Gap junction intercellular communication，GJIC）功能。
　　結(jié)果 OGD缺氧復(fù)氧后0-24 h，神經(jīng)元細胞cx36表達量逐漸增加，復(fù)氧4h、12 h及24 h cx36表達量顯著高于正常對照組(p＜0.05)。與單純OGD缺氧1.5 h復(fù)氧4h的神經(jīng)元相比，經(jīng)30 uM ADMA預(yù)處理的神經(jīng)元在同樣的OGD條件下cx36的表達量下降(p＜0.05

17、)。熒光黃染料負荷實驗發(fā)現(xiàn)，對照組僅分布在劃痕兩側(cè)的神經(jīng)元有熒光黃染料浸潤;OGD組除劃痕兩側(cè)鄰近細胞有熒光黃染料的浸潤外，稍遠離劃痕的神經(jīng)元細胞亦有熒光黃染料浸潤;ADMA干預(yù)OGD組熒光黃染料浸潤情況與對照組相似。
　　結(jié)論 ADMA可下調(diào)OGD缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的cx36表達增加及GJIC功能增高，提示對cx36的調(diào)控是ADMA神經(jīng)保護作用的其中一個可能機制。
　　結(jié)論
　　1.缺血性卒中后外周血ADMA濃度升高。癥狀

18、嚴重程度不同，ADMA濃度的時間變化趨勢亦不同。
　　2.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA濃度可提示卒中后90d預(yù)后，ADMA及SDMA濃度越高，卒中預(yù)后越差。
　　3.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA濃度與炎癥指標有相關(guān)性。
　　3.ADMA可減輕OGD缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷，有神經(jīng)保護作用。
　　4.ADMA可下調(diào)OGD后神經(jīng)元cx36的表達，同時還可抑制OGD后GJIC功能，