血管內(nèi)皮鈣黏蛋白外功能區(qū)脫落對內(nèi)皮通透性的影響及在嚴重膿毒癥中的意義.pdf

1、背景膿毒癥尤其嚴重膿毒癥仍是面臨的主要健康問題之一,是重癥監(jiān)護病房(ICU)病人的首要死亡因為。內(nèi)皮細胞激活、功能障礙和損傷是嚴重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要特征。內(nèi)皮通透性增高所致微血管滲漏是嚴重膿毒癥和MODS的重要病理生理。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)為內(nèi)皮細胞特異性膜蛋白,是內(nèi)皮細胞之間黏附連接的主要成分。VE-cadherin介導的細胞間同型黏附在內(nèi)皮屏障和內(nèi)皮細胞其他功能的控制方面具有關鍵作用

2、。本研究擬:(1)探討內(nèi)皮細胞體外研究模型的選擇；(2)研究VE-cadherin胞外區(qū)即外功能區(qū)脫落在內(nèi)皮通透性增高中的作用；(3)檢測嚴重膿毒癥病人血清可溶性VE-cadherin(VE-cadherin外功能區(qū))水平,并探討其與疾病嚴重程度及預后的關系。
　　 材料和方法：用原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為陽性對照,從蛋白水平和mRNA水平分析廣泛作為內(nèi)皮細胞體外研究模型的ECV304細胞系VE-cadherin的表達

3、。以重組人基質(zhì)金屬蛋白酶9(rMMP-9)裂解VE-cadherin胞外區(qū),研究VE-cadherin外功能區(qū)脫落對內(nèi)皮通透性、肌動蛋白細胞骨架和RhoA的影響。收集入住SICU的重癥病人28例,其中嚴重膿毒癥15例,非膿毒癥重癥病人13例,健康志愿者13例。對比分析嚴重膿毒癥血清可溶性鈣黏蛋白水平,并分析和APACHEⅡ評分及死亡的相關性。內(nèi)皮細胞VE-cadherin的蛋白水平檢測采用免疫熒光法(IF)和免疫印跡法(WB)。VE-c

4、adherin在mRNA水平的檢測應用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。內(nèi)皮通透性測定采用FITC-葡聚糖透過Transwell方法測定。肌動蛋白細胞骨架采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色熒光顯微鏡下觀察。RhoA表達以WB法檢測。細胞培養(yǎng)液和人血清可溶性VE-cadherin檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(Elisa)。
　　 結果：(1)已廣泛用作內(nèi)皮細胞體外研究模型的ECV304細胞系在蛋白水平和mRNA水平均未檢測到VE-cadhe

5、rin。(2)VE-cadherin外功能區(qū)脫落明顯增高了內(nèi)皮通透性；激活內(nèi)皮細胞RhoA,引起肌動蛋白細胞骨架重組和內(nèi)皮細胞間隙形成；(3)和健康志愿者及非嚴重膿毒癥的重癥病人相比,嚴重膿毒癥病人血清可溶性VE-cadherin水平明顯增高(P<0.0001)。重癥病人血清可溶性VE-cadherin水平和APACHEⅡ評分呈直線相關(相關系數(shù)r=0.577,P<0.01)。嚴重膿毒癥死亡者血清可溶性VE-cadherin水平明顯高于

6、生存者(P<0.01)。最后,我們用嚴重膿毒癥病人血清刺激HUVEC,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞連接處VE-cadherin明顯減少,并且VE-cadherin總量明顯降低。
　　 結論：(1)ECV304細胞系不表達VE-cadherin,缺乏內(nèi)皮細胞重要特征,不應作為內(nèi)皮細胞體外研究模型；(2)VE-cadherin外功能區(qū)脫落后可發(fā)生由外向內(nèi)的細胞信號轉(zhuǎn)導作用,激活RhoA,引起肌動蛋白細胞骨架重組和內(nèi)皮細胞間隙形成,對內(nèi)皮通透性具有重