肺炎鏈球菌溶血素致感染性腦損傷動物模型的建立.pdf

1、背景和目的:
　　 感染性腦損傷包括顱內感染(結核性腦膜炎、病毒性腦炎及化膿性腦膜炎)和顱外感染(中毒性痢疾及敗血癥、中毒性肺炎等)等所致的腦損傷,是兒科常見的危重癥之一。細菌性感染是其主要的病因,以革蘭陽性球菌感染最為常見,其中肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染最常見的病原體之一,其廣泛分布于自然界,常寄居于正常人的鼻咽腔中,兒童鼻咽部帶菌率可高達24％～32％,研究

2、顯示Spn是細菌性肺炎及腦膜炎的主要病原體,同時也是兒童腦膜炎致死、致殘率最高的病原體。Spn感染后患兒多表現(xiàn)為突然發(fā)病,出現(xiàn)驚厥、高熱與昏迷等伴隨癥狀,尸檢可以發(fā)現(xiàn)腦組織腫脹、淤血,腦重量與容積均增加。
　　 報道稱革蘭氏陽性菌崩解后產(chǎn)生的溶血素(Pneumolysin,PLY)在感染性腦損傷中具有重要的作用,是最為重要的肺炎球菌細胞毒素,是肺炎球菌中唯一能破壞機械性宿主防御、補體和免疫應答的毒力因子?？梢饛V泛的毒性效應,如

3、溶血、纖毛顫動、磷脂酶活化。PLY是一種屬于巰基激活毒素家族的,所有肺炎鏈球菌都有的一種胞內蛋白。但目前PLY在感染性腦損傷中發(fā)生發(fā)展的確切機制尚未完全闡明。
　　 研究顯示將含有肺炎鏈球菌菌落的生理鹽水注入小鼠動脈內制成動物腦膜炎模型后,血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)的緊密連接被破壞；另有研究發(fā)現(xiàn),純化的PLY在體外實驗中可以誘導小膠質細胞和神經(jīng)細胞凋亡。但是目前,國內外學者多采用腹腔、腦內直接注射

4、肺炎鏈球菌或體外神經(jīng)細胞培養(yǎng)等方法來研究肺炎鏈球菌及其溶血素致腦損傷的機制,直接用PLY注入實驗動物體內的方法建立感染性腦損傷模型尚未見報道。本研究將根據(jù)人體疾病發(fā)生過程,客觀模擬嬰幼兒經(jīng)血流途徑致腦損傷感染過程建立動物模型,將革蘭氏陽性菌的主要毒力因子-肺炎鏈球菌溶血素(P啪直接注入實驗動物動脈血流,使其到達腦組織,而引起病理改變,為更深入、全面和客觀地研究PLY至感染性腦損傷的發(fā)病機制而打下基礎。
　　 材料和方法:

5、　　 選取健康普通級1月齡SD大鼠160只,體重100～120g,平均(105±10g),雌雄不限,隨機平均分為PLY組和NS組,其中PLY組(實驗組):SD大鼠80只,頸內動脈注射PLY(劑量:0.2ml(7μg),NS組(對照組):SD大鼠80只,頸內動脈注射等體積生理鹽水。根據(jù)不同觀察時間點(注射后6h、12h、24h及48h),將PLY組SD大鼠分為4個亞組,每個亞組中分別有10只注射EB,測定不同時間點腦組織EB含量；注射E

6、B組經(jīng)右頸外靜脈近心端注入2％EB(2ml／kg),推注時間大約1～2分鐘。各組處理后,待觀察至相應時間點,將大鼠麻醉行心臟灌注后斷頭取腦,用于制作腦組織標本,以備觀察。腦組織EB含量測定采用甲酰胺法,不同時間點BWC測定采用干濕重法,此外,利用免疫組化法檢測腦組織NSE、GFAP蛋白的表達。應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用的統(tǒng)計方法為t檢驗；檢驗水準為P<0.05。
　　 結果:
　　 1.形態(tài)學觀察:與NS

7、組相比,采用HE染色光鏡下觀察,PLY組腦組織可見血管擴張、血管周圍間隙的增寬、炎細胞浸潤、神經(jīng)元空泡變性、星形膠質細胞體積的增大腫脹、細胞核固縮等改變。
　　 2.腦組織含水量和EB含量:注射6h后,PLY組腦組織含水量和EB含量開始增加,24h達到高峰,各時間點均顯著高于NS組(p<0.05)。
　　 3.腦組織NSE和GFAP蛋白含量:注射6h后,PLY組NSE、GFAP蛋白開始增加,24h達高峰,48h仍維持較高

8、水平,各時間點均顯著高于NS組(p<0.05)。
　　 4.相關性分析:PLY組腦組織含水量和EB含量、NSE蛋白表達量和腦組織含水量、NSE蛋白表達量和EB含量、GFAP蛋白表達量和腦組織含水量、GFAP蛋白表達量和EB含量、NSE蛋白表達量和GFAP蛋白表達量均成正相關。
　　 結論:
　　 1.經(jīng)大鼠頸內動脈注射PLY后,腦組織含水量增加,腦組織EB含量增加,血腦屏障(BBB)通透性增加,腦組織NSE蛋白、