肺炎鏈球菌溶血素致感染性腦損傷動(dòng)物模型的建立.pdf

1、背景和目的:
　　 感染性腦損傷包括顱內(nèi)感染(結(jié)核性腦膜炎、病毒性腦炎及化膿性腦膜炎)和顱外感染(中毒性痢疾及敗血癥、中毒性肺炎等)等所致的腦損傷,是兒科常見的危重癥之一。細(xì)菌性感染是其主要的病因,以革蘭陽性球菌感染最為常見,其中肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染最常見的病原體之一,其廣泛分布于自然界,常寄居于正常人的鼻咽腔中,兒童鼻咽部帶菌率可高達(dá)24％～32％,研究

2、顯示Spn是細(xì)菌性肺炎及腦膜炎的主要病原體,同時(shí)也是兒童腦膜炎致死、致殘率最高的病原體。Spn感染后患兒多表現(xiàn)為突然發(fā)病,出現(xiàn)驚厥、高熱與昏迷等伴隨癥狀,尸檢可以發(fā)現(xiàn)腦組織腫脹、淤血,腦重量與容積均增加。
　　 報(bào)道稱革蘭氏陽性菌崩解后產(chǎn)生的溶血素(Pneumolysin,PLY)在感染性腦損傷中具有重要的作用,是最為重要的肺炎球菌細(xì)胞毒素,是肺炎球菌中唯一能破壞機(jī)械性宿主防御、補(bǔ)體和免疫應(yīng)答的毒力因子。可引起廣泛的毒性效應(yīng),如

3、溶血、纖毛顫動(dòng)、磷脂酶活化。PLY是一種屬于巰基激活毒素家族的,所有肺炎鏈球菌都有的一種胞內(nèi)蛋白。但目前PLY在感染性腦損傷中發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　 研究顯示將含有肺炎鏈球菌菌落的生理鹽水注入小鼠動(dòng)脈內(nèi)制成動(dòng)物腦膜炎模型后,血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)的緊密連接被破壞；另有研究發(fā)現(xiàn),純化的PLY在體外實(shí)驗(yàn)中可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但是目前,國內(nèi)外學(xué)者多采用腹腔、腦內(nèi)直接注射

4、肺炎鏈球菌或體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)等方法來研究肺炎鏈球菌及其溶血素致腦損傷的機(jī)制,直接用PLY注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的方法建立感染性腦損傷模型尚未見報(bào)道。本研究將根據(jù)人體疾病發(fā)生過程,客觀模擬嬰幼兒經(jīng)血流途徑致腦損傷感染過程建立動(dòng)物模型,將革蘭氏陽性菌的主要毒力因子-肺炎鏈球菌溶血素(P啪直接注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血流,使其到達(dá)腦組織,而引起病理改變,為更深入、全面和客觀地研究PLY至感染性腦損傷的發(fā)病機(jī)制而打下基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:

5、　　 選取健康普通級1月齡SD大鼠160只,體重100～120g,平均(105±10g),雌雄不限,隨機(jī)平均分為PLY組和NS組,其中PLY組(實(shí)驗(yàn)組):SD大鼠80只,頸內(nèi)動(dòng)脈注射PLY(劑量:0.2ml(7μg),NS組(對照組):SD大鼠80只,頸內(nèi)動(dòng)脈注射等體積生理鹽水。根據(jù)不同觀察時(shí)間點(diǎn)(注射后6h、12h、24h及48h),將PLY組SD大鼠分為4個(gè)亞組,每個(gè)亞組中分別有10只注射EB,測定不同時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量；注射E

6、B組經(jīng)右頸外靜脈近心端注入2％EB(2ml／kg),推注時(shí)間大約1～2分鐘。各組處理后,待觀察至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),將大鼠麻醉行心臟灌注后斷頭取腦,用于制作腦組織標(biāo)本,以備觀察。腦組織EB含量測定采用甲酰胺法,不同時(shí)間點(diǎn)BWC測定采用干濕重法,此外,利用免疫組化法檢測腦組織NSE、GFAP蛋白的表達(dá)。應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用的統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察:與NS

7、組相比,采用HE染色光鏡下觀察,PLY組腦組織可見血管擴(kuò)張、血管周圍間隙的增寬、炎細(xì)胞浸潤、神經(jīng)元空泡變性、星形膠質(zhì)細(xì)胞體積的增大腫脹、細(xì)胞核固縮等改變。
　　 2.腦組織含水量和EB含量:注射6h后,PLY組腦組織含水量和EB含量開始增加,24h達(dá)到高峰,各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NS組(p<0.05)。
　　 3.腦組織NSE和GFAP蛋白含量:注射6h后,PLY組NSE、GFAP蛋白開始增加,24h達(dá)高峰,48h仍維持較高

8、水平,各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NS組(p<0.05)。
　　 4.相關(guān)性分析:PLY組腦組織含水量和EB含量、NSE蛋白表達(dá)量和腦組織含水量、NSE蛋白表達(dá)量和EB含量、GFAP蛋白表達(dá)量和腦組織含水量、GFAP蛋白表達(dá)量和EB含量、NSE蛋白表達(dá)量和GFAP蛋白表達(dá)量均成正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注射PLY后,腦組織含水量增加,腦組織EB含量增加,血腦屏障(BBB)通透性增加,腦組織NSE蛋白、