家蠶腸道產(chǎn)酶益生菌的分離鑒定及其作用機(jī)理研究.pdf

1、腸道益生菌對動物健康生長有著十分重要的作用，其中腸道細(xì)菌是一類重要的益生菌，可在動物腸道產(chǎn)酶等發(fā)揮重要的助消化和抗病作用。論文主要從五個方面研究家蠶腸道產(chǎn)蛋白酶益生細(xì)菌的作用及其機(jī)理。
　　 為探明家蠶腸液蛋白酶活力的基本消化生理特性，從4-5齡家蠶幼蟲腸道內(nèi)容物中分離出蛋白酶酶液，在不同溫度、pH及金屬離子處理條件下，用福林-酚法測定酶活力變化情況，確定家蠶腸液蛋白酶的最適作用條件，同時研究了家蠶中腸蛋白酶活力隨齡期增長的變化

2、規(guī)律。結(jié)果表明：在35℃、pH10.0左右條件下蛋白酶活力最大，低濃度Mn2+、Fe2+、Cu2+對酶活有抑制作用，高濃度Ca2+對酶有抑制作用，Mg2+濃度對酶活物影響不明顯，家蠶中腸蛋白酶活力隨齡期增長而增強(qiáng)。
　　 為探明家蠶腸道中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的種類分布及其作用效果，以家蠶4-5齡幼蟲腸道內(nèi)容物為材料，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基分離篩選產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌菌株，利用菌落與菌體形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合16SrDNA序列分析鑒定其種

3、屬，結(jié)果獲得4株產(chǎn)蛋白酶菌株“NA1”、“951 NA3”、“951NA6”和“951 NA4”，前3株均歸屬于不動桿菌屬，951 NA4歸屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subilis。
　　 根據(jù)已經(jīng)克隆得到的枯草芽孢桿菌蛋白酶基因設(shè)計引物，對所分離得到的枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)蛋白酶基因進(jìn)行克隆，分別得到2644bp和1447bp的兩個基因序列，將這兩段序列與Genbank已有序列進(jìn)行B1ast比對分析，分別與枯草芽孢桿菌中性

4、蛋白酶基因和堿性蛋白酶基因有98％、99％的同源性，用MEGA4軟件分別對其進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果均符合預(yù)期要求，鑒定該試驗克隆得到的兩段基因序列均為枯草芽孢桿菌蛋白酶基因序列。把枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因連入pET-28(a+)載體，將酶切產(chǎn)物連接進(jìn)pET28a-npr后構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌Transetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的酶蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析目的蛋白分子量約為60 kD，上清液酶活為13.66

5、U·mL-1。
　　 為提高枯草芽孢桿菌蛋白酶的高效利用，對該菌株適宜發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：各因素對枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性影響的大小順序依次為：pH值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>裝液量；最適的產(chǎn)酶條件為：pH7.0，培養(yǎng)溫度：30℃，培養(yǎng)時間：36 h；對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶進(jìn)行初步提純后并研究得出該酶反應(yīng)的最適DH10.0，最適反應(yīng)溫度為：60℃；該酶為堿性蛋白酶、不耐高溫、不耐酸，但在35℃條件下熱穩(wěn)定性較好。

6、r>　　 對該枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行家蠶桑葉添飼實驗，分別設(shè)置試驗組和對照組，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)200頭家蠶。從3齡開始，試驗組桑葉添加含酶菌液，研究桑葉添加含酶菌液對家蠶生長及生產(chǎn)性能相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：隨著齡期的增長，試驗組增重較對照組逐漸出現(xiàn)明顯的差異。對照組平均蛹重為1.2449g/只，實驗組為1.3704g/只；對照組平均繭殼重量為0.4030g，實驗組為0.4330g。對照組繭層率為24.46％，實驗組為24.0