過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)激活對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的HepG2細胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是不同于死亡受體途徑或線粒體損傷途徑的第三種細胞凋亡途徑。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎、酒精性肝損傷、脂肪肝、肝臟缺血再灌注損傷等肝臟損傷都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡有著密切的關(guān)系,因此抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕細胞凋亡是防治肝臟損傷的重要環(huán)節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活受體-α(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-α

2、,PPARα)是配體激活的核受體PPARs家族的三個亞型之一,參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。研究表明PPARα的選擇性激動劑WY14643可以抑制細胞凋亡,對重要臟器如心臟、肝臟、大腦和腎臟的缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護作用,而PPARα的選擇性拮抗劑MK886可引起細胞凋亡。我們前期研究也表示,WY14643對在體肝臟部分缺血再灌注損傷和大鼠肝細胞缺氧復(fù)氧損傷均具有保護作用,而這一作用是否與ERS有關(guān)尚未可知,本研究旨在探討PPARα激活對ERS誘

3、導的人肝癌細胞株(HepG2)凋亡的影響,以闡明其肝臟保護作用的機制。
　　方法：首先,為明確誘導HepG2細胞凋亡的最適過氧化氫(H2O2)濃度,選擇0.1mM、1mM、3mM的H2O2刺激HepG2細胞6小時,并分別設(shè)置control組、WY14643alone組、DMSOalone組、WY14643預(yù)先給藥組和DMSO預(yù)先給藥組對比,采用MTT比色法和DAPI-PI雙染法檢測各組細胞活力;然后,根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇最適的H2

4、O2作用濃度,設(shè)置control組、DMSOalone組、WY14643alone組、H2O2alone組、WY14643+H2O2組和DMSO+H2O2組,采用賴氏法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性,TBA法檢測各組HepG2細胞丙二醛(MDA)含量,RT-PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志分子BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平,WB法檢測PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平,觀察WY14643對H2O

5、2誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響;最后,設(shè)置DMSOalone組、MK886alone組、H2O2alone組、WY14643+H2O2組和MK886+WY14643+H2O2組,采用賴氏法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力,TBA法檢測細胞MDA含量,RT-PCR法檢測BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平,WB法檢測PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平,AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組細胞調(diào)亡率,免疫熒光法觀察CHO

6、P蛋白質(zhì)在各組細胞內(nèi)定位及表達量,明確WY14643的作用是否依賴于PPARα的激活。統(tǒng)計學處理:采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以均數(shù)±標準差(x—±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：MTT比色法和DAPI-PI雙染法顯示,與對照組比較,DMSOalone組、WY14643alone組和0.1mMH2O2均不改變細胞活力,而1mMH2O2組和3mMH2O2組細胞活力

7、明顯降低(P<0.05);與1mMH2O2組,WY14643+1mMH2O2組細胞活力分別由59.6％±9.6%和56.1%±5.6%提高至92.6%±14.2%和96.4%±3.8%(P<0.05),DMSO+1mMH2O2組細胞活力無明顯變化;和3mMH2O2組相比,WY14643+3mMH2O2組細胞活力分別由30.2%±3.5%和32.0%±4.7%提高至45.6%±4.0%和52.8%±6.0%(P<0.05),DMSO+3m

8、MH2O2組細胞活力無明顯變化。因此,后續(xù)試驗H2O2作用濃度均選擇1mM。
　　與control組相比,H2O2alone組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強(P<0.05),細胞MDA含量增加(P<0.05),BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(P<0.05),PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),而WY14643alone組除PPARα蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)外,其余指標均無明顯變化,DMSOal

9、one組各項指標均無明顯變化;而與H2O2alone組相比,WY14643+H2O2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力顯著下降(P<0.05),細胞MDA含量降低(P<0.05),BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(P<0.05),BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)(P<0.05),而DMSO+H2O2組則無明顯變化。
　　與DMSOalone組相比,H2O2alone組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強(P<0.05),細胞

10、MDA含量增加(P<0.05),BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(P<0.05),PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)(P<0.05),MK886alone組和MK886+WY14643+H2O2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強(P<0.05),細胞MDA含量增加(P<0.05),BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(P<0.05),BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)(P<0.05),而PPARα蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)(

11、P<0.05);與H2O2alone組相比,WY14643+H2O2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力顯著下降(P<0.05),細胞MDA含量降低(P<0.05),BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(P<0.05),BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)(P<0.05);與WY14643+H2O2組相比,MK886+WY14643+H2O2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強(P<0.05),細胞MDA含量增加(P<0.05),BiP和

12、CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(P<0.05),BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)(P<0.05),而PPARα蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),與control組相比,H2O2alone組和MK886alone組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05),而WY14643alone組則無明顯變化;與H2O2alone組相比,WY14643+H2O2組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05);而與WY14643+H2O

13、2組相比,MK886+WY14643+H2O2組細胞凋亡率又顯著性回升(P<0.05)。最后,觀察到control組CHOP蛋白質(zhì)均位于細胞質(zhì);而與control組相比,H2O2alone組和MK886alone組CHOP蛋白質(zhì)表達增加,且大部分位于細胞核;與H2O2alone組相比,WY14643+H2O2組CHOP表達顯著減少,且主要居于細胞質(zhì);而與WY14643+H2O2組相比,MK886+WY14643+H2O2組CHOP表達現(xiàn)