重組人促紅細(xì)胞生成素抑制自噬減輕心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷.pdf

1、目的：
　　通過建立過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型，觀察不同濃度范圍的重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并初步探討rhEPO的保護(hù)作用對自噬的影響和可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.選取健康的SD雄性大鼠心臟的左心室心肌，利用改良組織塊貼壁法獲得心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardica microvasc

2、ular endothelial cells, CMECs）；通過倒置顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采用vWF因子相關(guān)抗原免疫熒光法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.采用H2O2構(gòu)建心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，利用MTT比色法測定細(xì)胞存活率，確定H2O2處理細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷的適宜時間和濃度。3.用不同濃度（5、10、20、40U/ml）rhEPO和200umol/l H2O孵育心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用MTT比色法測定細(xì)胞存活率，并用化學(xué)比色法

3、測定不同rhEPO濃度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量，確定rhEPO有效濃度范圍。4.用Western-blot方法檢測各組細(xì)胞LC3Ⅱ和Beclin1的蛋白表達(dá)量，觀察有效濃度范圍的重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對氧化應(yīng)激模型中的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的影響。5.用Western-blot方法檢測各組細(xì)胞p-mTOR的表達(dá)量，觀察不同濃度rhEPO對p-mTOR

4、誘導(dǎo)表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)CMECs一周后，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形和多角形等不規(guī)則形，形成單層緊密排列時呈鵝卵石樣結(jié)構(gòu)；免疫熒光檢測FITC標(biāo)記vWF相關(guān)抗體陽性率90％以上；2.與正常對照組相比，當(dāng)H2O2濃度為200umol/l，作用時間為2小時，細(xì)胞生存狀態(tài)差，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低（p<0.05）。因此本實驗選用200umol/l H2O2，處理2小時，為建模濃度和時間。3.與正常對照組相比，

5、200umol/l H2O2處理的各組細(xì)胞，存活率降低(P<0.05)，LDH釋放量增加（P<0.05）；不同濃度rhEPO預(yù)處理的細(xì)胞，與單純 H2O2組相比，上述指標(biāo)可明顯逆轉(zhuǎn)（P<0.05），但40U/mlrhEPO和20U/mlrhEPO相比，逆轉(zhuǎn)不明顯（P>0.05）。4.與正常對照組相比，單純H2O2處理組LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）；不同濃度的rhEPO預(yù)處理后，LC3Ⅱ和Beclin1蛋白

6、表達(dá)量可明顯減低，與單純H2O2組相比均具有顯著差異（P<0.05）。5.與正常對照組相比，單純 H2O2組p-mTOR的表達(dá)降低（P<0.05）;不同濃度的rhEPO預(yù)處理后，均能誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞p-mTOR的表達(dá)增高，與單純H2O2組相比有顯著差異（P<0.05）,且存在濃度依存性。
　　結(jié)論：
　　1.H2O2可以誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷并引起細(xì)胞過度自噬；2.一定濃度范圍內(nèi)rhEPO對H2O2誘導(dǎo)的心肌微