肌醇六磷酸與肌醇合用對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用的研究.pdf

1、目的：通過(guò)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)和建立裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，觀察肌醇六磷酸（IP6）和肌醇（Ins）合用對(duì)多種癌細(xì)胞增殖的抑制效果及對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，探討IP6與Ins合用能否增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
　　方法：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人胃癌細(xì)胞7901、人乳癌細(xì)胞MCF-7和人肺癌細(xì)胞A549，接種于96孔板中，分別加入0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L的IP6、Ins及

2、IP6+Ins（1:1,V/V）混合液，另設(shè)對(duì)照組（不加藥物）。應(yīng)用四基偶氮噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)（MTT法）測(cè)定不同濃度的IP6和Ins合用作用不同癌細(xì)胞48h的抑制率，計(jì)算IP6和Ins合用作用于不同癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取兩種對(duì)IP6和Ins合用更為敏感的癌細(xì)胞，將IP6和Ins以不同比例（9:1、3:1、1:1、1:3、1:9,V/V）作用于兩種癌細(xì)胞，計(jì)算抑制率。根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)IP6和Ins合用最敏感的癌細(xì)胞

3、，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，在無(wú)菌條件下，于裸鼠右前肢的背部采用皮下注射細(xì)胞懸液0.2ml（含2×106個(gè)細(xì)胞），建立裸鼠人移植瘤模型。待接種小鼠均出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，其徑長(zhǎng)均大于5mm時(shí)，按移植瘤體積隨機(jī)分為4組，每組10只，即IP6組、Ins組、IP6+Ins組、生理鹽水組。IP6組、Ins組、IP6+Ins組的藥物濃度均為15mmol/kg，IP6和Ins以（1:1,V/V）合用，陰性對(duì)照組每日0.1ml/10g生理鹽水，藥物注射采用腹腔注射

4、。每天稱重一次。20天后將所有裸鼠處死，取實(shí)驗(yàn)相關(guān)的腫瘤、肝、腎、血液等樣本。經(jīng)HE染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法測(cè)定PCNA、Cyclin D1、CDK4蛋白的表達(dá)；應(yīng)用Rt-PCR法測(cè)定RbmRNA、E2F-1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：不同濃度的IP6與Ins合用對(duì)5種癌細(xì)胞均能產(chǎn)生顯著的抑制作用（F=8.253～15.292，t=6.871～8.537，P<0.05）。對(duì)HepG2、HT

5、-29、7901、MCF-7、A549細(xì)胞的最高抑制率分別為68.82％、63.63%、37.07%、39.73%、39.26%；不同濃度的IP6和Ins合用沒(méi)有顯著提高對(duì)HT-29、7901、MCF-7、A549細(xì)胞的抑制作用（F=1.195～2.408，t=0.978～2.133，P>0.05），但在4mmol/L時(shí)，合用組對(duì)HepG2細(xì)胞抑制效果顯著高于IP6組和Ins組（t=7.462，P<0.05）。IP6和Ins合用作用于5

6、種癌細(xì)胞時(shí)，HepG2和HT-29細(xì)胞的IC50值最低，但I(xiàn)P6和Ins合用未能顯著降低各癌細(xì)胞的IC50值。將IP6和Ins以不同比例合用發(fā)現(xiàn)，IP6和Ins合用的比例對(duì)HepG2和HT-29細(xì)胞的抑制效果沒(méi)有影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)前后測(cè)量各組裸鼠體重的變化發(fā)現(xiàn)，腹腔注射IP6、Ins及兩種藥物的混合液對(duì)裸鼠的體重變化沒(méi)有影響。裸鼠處死后，無(wú)菌剝?nèi)∧[瘤并對(duì)腫瘤進(jìn)行稱重和測(cè)量體積，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤均小于對(duì)照組，其中IP6與Ins合用組腫瘤最小

7、，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組均出現(xiàn)不同程度的腫瘤形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞大小不一，形狀不規(guī)則等。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組PCNA蛋白的表達(dá)呈不同程度的降低，IP6與Ins的合用組表達(dá)水平最低，但差異無(wú)顯著性（P>0.05）。與對(duì)照組比較，IP6組、Ins組、合用組能顯著降低CyclinD1、CDK4蛋白的表達(dá)（P<0.05）；與IP6組、Ins組比較，合用組能顯著降低CDK4蛋白表達(dá)水平，

8、對(duì)CyclinD1蛋白表達(dá)的抑制無(wú)顯著增強(qiáng)作用。Rt-PCR結(jié)果顯示，IP6組、Ins組及合用組的Rb mRNA的表達(dá)水平相比對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，IP6、兩者合用對(duì)E2F-1 mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有影響，Ins組E2F-1 mRNA的表達(dá)相比對(duì)照組有所下降(P<0.05)；與IP6組、Ins組比較，合用組對(duì)Rb mRNA、E2F-1 mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響(P>0.05)。
　　結(jié)論：IP6和Ins合用對(duì)五種癌細(xì)胞的增