豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株HN07-1純化及PRRSV-IPMA篩選單克隆抗體.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原體，能引起母豬繁殖障礙及各年齡段豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀。PRRSV是有囊膜的、單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目動脈炎病毒科，直徑大約50～65nm，表面相對平滑，病毒粒子形

2、態(tài)多樣，以球形為主。PRRSV作為一種囊膜病毒，在宿主外的生存受溫度、pH、光照和培養(yǎng)基的影響。PRRSV熱穩(wěn)定性較差，其感染力隨溫度增加而降低；pH6.5～7.5時保持穩(wěn)定，在其他條件下病毒的感染能力下降，因此，PRRSV的純化工作難度較大，需要嚴(yán)格控制溫度、pH值等因素。目前一般采用超速離心沉淀法和蔗糖密度梯度離心法純化PRRSV，但這些方法操作繁瑣、費時，難以大規(guī)模純化病毒，并且對儀器設(shè)備的要求較高。此外，對于有囊膜結(jié)構(gòu)的病毒來說

3、，超速離心沉淀病毒和蔗糖的高黏稠和高滲透性會對病毒顆粒造成損傷，導(dǎo)致病毒感染能力下降及囊膜蛋白的丟失。
　　為了克服以上缺點，本實驗建立了一種溫和純化PRRSV方法，即采用差速離心、膜包超濾濃縮和Sepharose4Fast Flow（4FF）凝膠層析相結(jié)合的策略純化PRRSV。通過SDS-PAGE，Western-blot和檢測蛋白含量、病毒含量等方法分析純化效果，結(jié)果表明4FF純化后的病毒TCID50提高了50倍，病毒原液雜蛋

4、白的去除比率為99.68％，SDS-PAGE結(jié)果圖顯示未見明顯雜蛋白條帶；將純化好的病毒與等體積的弗氏佐劑乳化后免疫BALB/C雌性小鼠，通過免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗（IPMA）檢測其免疫效果，IPMA結(jié)果表明4FF純化病毒的免疫原性較好，特異性較強(qiáng)，消除了免疫后小鼠血清與Marc-145細(xì)胞蛋白的非特異性反應(yīng)。
　　按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞株，融合前加強(qiáng)免疫一次，取其脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，分別

5、在CRL-2843-CD163細(xì)胞系和Marc145細(xì)胞系上采用IPMA試驗篩選，共篩選到陽性克隆孔15株，挑選其中的5株陽性孔進(jìn)行亞克隆化，獲得5株能穩(wěn)定分泌PRRSV抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D1，9D4，6E7，7G8，7F12，其腹水IPMA效價均在1:106以上。用大腸桿菌表達(dá)的重組PRRSV N蛋白包被ELISA板，以抗PRRSV陽性克隆細(xì)胞上清為一抗作間接ELISA，檢測抗PRRSV N蛋白單抗；用蛋白質(zhì)印跡（

6、Western-blotting）試驗進(jìn)一步驗證，間接ELISA和Western-blotting結(jié)果表明1D1，9D4，7G8三株是針對PRRSV核衣殼N蛋白的特異性單抗，而6E7，7F12是針對PRRSV其它結(jié)構(gòu)蛋白表位。
　　本實驗的意義：一是建立了一種溫和純化PRRSV的方法，為規(guī)模化純化PRRSV疫苗的工藝開發(fā)奠定基礎(chǔ)；二是建立了在不同細(xì)胞系上采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗（IPMA）篩選出多株抗PRRSV單克隆抗體為研