雷公藤內(nèi)酯醇抗未分化型甲狀腺癌的血管生成和侵襲的作用及機(jī)制.pdf

1、未分化型甲狀腺癌是甲狀腺腫瘤里惡性程度最高、破壞性最強(qiáng)的類型，它的發(fā)病率僅占全部甲狀腺腫瘤的2-5％，但死亡病例卻占了50％以上。此類病人一經(jīng)診斷即不再適合進(jìn)行手術(shù)治療，而病人對傳統(tǒng)的放療和化療也不敏感，因此中位生存率僅為3-4個月。因此，尋找一種高效的新的治療方法對延長未分化型甲狀腺癌病人的生命和改善預(yù)后具有重要的意義。血管生成和侵襲是惡性腫瘤的兩大標(biāo)志性惡性生物學(xué)行為，它們在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色。造成未分化型甲狀腺癌的

2、預(yù)后極差的原因，主要就是病理性血管豐富引起的生長迅速和易較早發(fā)生致命性的局部侵襲和轉(zhuǎn)移。在促進(jìn)腫瘤的血管生成和侵襲的眾多因素中，血管內(nèi)皮生長因子VEGF最受人矚目。VEGF不僅能調(diào)控血管生成過程中的多個步驟，而且還能通過直接降解內(nèi)皮屏障等來促進(jìn)侵襲。VEGF表達(dá)受多個機(jī)制的調(diào)控，其中NF-κB是促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。因此，靶向抑制NF-κB通路可以為具有病理性血管增生和侵襲行為的惡性腫瘤提供一個新的治療手段。雷公藤內(nèi)酯醇(t

3、riptolide)是從傳統(tǒng)中藥衛(wèi)矛科植物雷公藤中抽提出來的小分子化合物。它具有抗炎抗免疫的作用，臨床上常應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎等免疫系統(tǒng)疾病。近來發(fā)現(xiàn)triptolide在腫瘤細(xì)胞上具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，并且還能抑制體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但是，對其是否具有抑制血管生成和侵襲的作用還不得而知。
　　 目的：對triptolide處理過的人未分化型甲狀腺癌細(xì)胞株TA-K進(jìn)行檢測，觀察triptolide對TA-K細(xì)胞的

4、增殖、凋亡、侵襲能力的影響，以及通過體內(nèi)外血管生成模型觀察triptolide對未分化型甲狀腺癌的血管生成的影響；并進(jìn)一步分析研究triptolide抗血管生成和侵襲等作用的可能機(jī)制，初步探討triptolide對NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄激活抑制在triptolide抗腫瘤中的作用，為將來把triptolide開發(fā)成為高效的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 ㈠Triptolide對人未分化型甲狀腺癌TA-K

5、細(xì)胞的增殖及凋亡的影響。
　　 方法：人未分化型甲狀腺癌細(xì)胞株TA-K細(xì)胞的培養(yǎng)；甲基偶氮唑藍(lán)比色法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyi tetrazolium bromide，MTT)測定細(xì)胞生存率；BrdU參入比色法檢測細(xì)胞增殖情況；Hoechst核染色和caspase3活性檢測觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：triptolide既能抑制TA-K細(xì)胞的增殖，又能在24小

6、時(shí)后明顯誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　 ㈡Triptolide對體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、小管形成的影響及對體內(nèi)未分化甲狀腺癌腫瘤模型的血管生成和腫瘤生長的影響。
　　 方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVECs細(xì)胞的培養(yǎng)；MTT法檢測細(xì)胞生存率；Hoechst核染色觀察細(xì)胞凋亡情況；體外transwell小室模型檢測細(xì)胞遷移/侵襲能力；體外血管生成模型檢測內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力；Matrigel plugs assay檢測體內(nèi)成瘤的血

7、管生成狀況和腫瘤生長情況；血紅蛋白量的檢測和免疫組化法染色CD31觀察腫瘤內(nèi)的新生血管量；免疫組化法檢測腫瘤內(nèi)的VEGF的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：在體外，一方面triptolide能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成；另一方面triptolide能通過減少腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子VEGF的分泌來抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成。在體內(nèi)，triptolide能抑制TA-K細(xì)胞所形成腫瘤的生長及血管生成，且能降低VEGF的表達(dá)。

8、
　　 ㈢Triptolide對體外TA-K細(xì)胞的侵襲的影響。
　　 方法：MTT法檢測相對細(xì)胞數(shù)目；體外transwell小室模型檢測細(xì)胞侵襲能力。
　　 結(jié)果：在體外侵襲模型中，triptolide呈時(shí)間和劑量依賴性地降低TA-K細(xì)胞的侵襲能力。
　　 ㈣Triptolide對未分化型甲狀腺癌的凋亡、增殖、血管生成及侵襲的影響的機(jī)制研究。
　　 方法：熒光素酶報(bào)告基因法檢測NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性

9、；蛋白免疫印跡法分別檢測p65蛋白水平、p65磷酸化水平、IκB-α蛋白水平、IκB-α磷酸化水平、cyclinD1、uPA、p53、p2l、Bcl-2、Bcl-XL、Bax；ELISA法檢測VEGF水平；凝膠電泳遷移率(EMSA)法檢測p65與DNA結(jié)合水平；免疫共沉淀法檢測p65與CREB結(jié)合蛋白(CBP)的結(jié)合水平；人工合成siRNA干擾p65。
　　 結(jié)果：在TA-K細(xì)胞上，triptolide能抑制NF-B的轉(zhuǎn)錄活性，

10、其機(jī)制是在前24小時(shí)內(nèi)主要通過抑制活性亞基p65與共同激動子CBP的結(jié)合，24小時(shí)后主要通過下調(diào)p65的表達(dá)；triptolide繼而能下調(diào)NF-κB的下游基因的表達(dá)，如促存活蛋白Bcl-2、Bcl-XL、細(xì)胞周期因子cyclinD1、血管生成因子VEGF、促侵襲因子uPA，從而能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的增殖、血管生成與侵襲。另外，干擾蛋白p65同樣能減少VEGF的分泌，并能抑制細(xì)胞的侵襲，說明NF-κB的轉(zhuǎn)錄抑制是與腫瘤的血管生成及侵

11、襲抑制是相關(guān)的。同樣在TA-K細(xì)胞上，p53蛋白水平的上調(diào)并沒有伴隨其所調(diào)控的誘導(dǎo)凋亡的下游基因p21與Bax的上調(diào)，反而下調(diào)，提示triptolide誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不是通過經(jīng)典的p53通路介導(dǎo)的。在另一株未分化型甲狀腺癌8505C細(xì)胞及HUVECs細(xì)胞上：triptolide同樣能抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，其機(jī)制均是直接通過下調(diào)p65的蛋白水平；并能下調(diào)與細(xì)胞增殖、遷移與血管生成相關(guān)的NF-κB的下游基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：

12、
　　 ⑴在體外，triptolide能抑制人未分化型甲狀腺癌的增殖、血管生成和侵襲并誘導(dǎo)凋亡。在體內(nèi)，它能抑制甲狀腺癌的生長及血管生成；
　　 ⑵重要的是，triptolide抑制血管生長的作用是通過雙靶向腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞而介導(dǎo)的：一方面減少腫瘤細(xì)胞的VEGF的表達(dá)，另一方面直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性與激活活動；
　　 ⑶Triptolide對腫瘤的凋亡、增殖、血管生成及侵襲的抑制作用主要是通過抑制p65與C