蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1對大鼠肝臟部分再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的： 1 構(gòu)建含TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transductiondomain，PTD)與HO-1(血紅素氧合酶-1，熱休克蛋白32)融合基因片斷的原核表達質(zhì)粒TAT-HO-1-pET32a，表達、純化TAT-HO-1-pET32a蛋白并鑒定其酶活、細胞毒性和體外/體內(nèi)進入肝細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。 2 建立將TAT-HO-1-pET32a蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入體外培養(yǎng)的PLC細胞及SD大鼠肝臟細胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。 3

2、建立成年SD大鼠的肝臟部分再灌注損傷模型。 4 探討TAT-HO-1-pET32a融合蛋白(血紅素氧合酶-1，熱休克蛋白32)對L-02細胞凋亡的保護作用。 5 探討TAT-HO-1-pET32a融合蛋白對SD大鼠肝臟部分再灌注損傷的保護作用，以期為實現(xiàn)臨床應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1技術(shù)以減輕肝臟部分再灌注損傷而奠定基礎(chǔ)。 方法： 1 采用PCR及克隆技術(shù)將HO-1編碼區(qū)基因與TAT-PTD連接到原核表達載體p

3、ET32a上，通過酶切及測序鑒定表達載體TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒是否正確。選取正確的TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL-21，用IPTG誘導(dǎo)E.coli BL-21表達TAT-HO-1-pET32a融合蛋白，通過Ni-NTA-agarose純化TAT-HO-1-pET32a融合蛋白，通過SDS-PAGE、Western-Blot鑒定融合蛋白。 2 測定TAT-HO-1-pET32a融合蛋白的酶活性，用CC

4、K-8 kit檢測TAT-HO-1-pET32a融合蛋白是否具有細胞毒性，通過將TAT-HO-1-pET32a融合蛋白加入體外培養(yǎng)的PLC細胞培養(yǎng)基中及自尾靜脈注射入SD大鼠體內(nèi)來檢測TAT-HO-1-pET32a融合蛋白體外/體內(nèi)進入細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。 3 體外培養(yǎng)L-02細胞實驗分組一：(Ⅰ)正常對照組(n=4)； (Ⅱ)THF-α(5000u/mL)l+CHX(1.5mg/mL)處理24h(n=4)； (Ⅲ)THF-α(50

5、00u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h(n=4)： (Ⅳ)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h(n=4)。通過CCK-8 kit檢測TAT-HO-1-pET32a蛋白對細胞凋亡的保護作用。 4 體外培養(yǎng)L-02細胞實驗分組二：(Ⅰ)正常對照組(n=4)；

6、(Ⅱ)THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h(n=4)；(Ⅲ)THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h(n=4)。通過AO-PI檢測TAT-HO-1-pET32a蛋白對L-02細胞凋亡的保護作用。 5 參照Nauta法建立成年SD大鼠的肝臟部分再灌注損傷模型；動物實驗分組：(Ⅰ)正常對照組(n=6只)，只行

7、假手術(shù)，給予開腹及暴露左、中肝葉肝蒂處理，不阻斷肝葉供血；(Ⅱ)缺血再灌注損傷組(n=6只)，左、中肝葉缺血60min，再灌注6 h：(Ⅲ)TAT-HO-1-pET32a組(n=6只)，缺血前自尾靜脈注射TAT-HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h，左、中肝葉缺血60min，再灌注6 h；(Ⅳ)HO-1-pET32a蛋白組(n=6只)，缺血前自尾靜脈注射HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h，左、中肝葉缺血

8、60min，再灌注6h。各組動物分別通過肝上下腔靜脈取血約2mL，并取肝臟標本，-80℃凍存留作檢測用，后處死。 6 動物標本檢測：分別檢測血清ALT、AST及組織中 SOD、MDA、MPO含量，缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞，光鏡下肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果： 1 質(zhì)粒TAT-HO-1-pET32a測序正確，融合蛋白TAT-HO-1-pET32a在E.coli BL-21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達、并成功

9、純化，經(jīng)Western-Blot定性鑒定為TAT-HO-1-pET32a蛋白，CCK-8 kit檢測融合蛋白無細胞毒性，酶活檢測融合蛋白的酶活性質(zhì)穩(wěn)定，可轉(zhuǎn)導(dǎo)入在體外培養(yǎng)的PLC細胞和SD大鼠的肝細胞。 2 加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h可將用THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h的體外培養(yǎng)的L-02細胞的生存率從25.52％±0.47％提高到41.76％±5.49％

10、，加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h可將L-02細胞的生存率從25.52％±0.47％提高到52.98％±6.29％。 3 與正常對照組相比再灌注損傷組、TAT-HO-1-pET32a組、HO-1-pET32a組的血清ALT、AST的水平顯著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著增高(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著增高(P<0.05)

11、，光鏡下組織學(xué)觀察肝組織損害明顯嚴重。TAT-HO-1-pET32a組與再灌注損傷組相比血清ALT、AST的水平顯著降低(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著增高(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著降低(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著降低(P<0.05)：光鏡下組織學(xué)觀察肝組織損害明顯減輕：凋亡指數(shù)為34.28％±3.00％，顯著低于再灌注損傷組的56.12％±1.71％(P<0.05)。HO-1-pET32a組與

12、TAT-HO-1-pET32a組相比血清ALT、AST的水平顯著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著增高(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著增高(P<0.05)；光鏡下組織學(xué)觀察肝組織損害明顯加重；凋亡指數(shù)為56.96％±2.63％，顯著高于TAT-HO-1-pET32a組的34.28％±3.00％(P<0.05)。HO-1-pET32a組與再灌注損傷組相比血清ALT、AS

13、T的水平、超氧化物歧化酶SOD水平、丙二醛MDA水平、髓過氧化物酶MPO水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；光鏡下組織學(xué)觀察肝組織損害程度較一致；凋亡指數(shù)為56.96％±2.63％，與再灌注損傷組的56.12％±1.71％相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1 成功構(gòu)建了原核表達載體TAT-HO-1-pET32a，得到了具有一定的酶活性、無細胞毒性并且可以體內(nèi)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞的TAT-HO-1-pET32a蛋白，為