菌酶聯(lián)合制備牦牛血抗氧化肽及其分離純化的研究.pdf

1、牦牛血作為牦牛（Bos mutus）屠宰過程中的主要副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)。本研究以牦牛血為原料，通過枯草芽孢桿菌SICC1.197液態(tài)發(fā)酵牦牛血制備抗氧化肽，以羥基自由基(·OH)清除率為主要指標(biāo)，通過單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件;在此基礎(chǔ)上，對發(fā)酵液進(jìn)行酶解，以多肽含量、·OH清除率為指標(biāo)，篩選出最適蛋白酶聯(lián)合發(fā)酵作用，通過單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件;分別采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵法、堿性蛋白酶解法、菌酶聯(lián)合法制備3種牦牛血抗氧化

2、肽（依次簡寫為BF、AP、BA），對比其·OH、超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力，脂質(zhì)過氧化抑制能力與還原力，確定最佳制備方法;利用超濾與凝膠層析技術(shù)分離純化牦牛血抗氧化肽;通過穩(wěn)定性試驗(yàn)，探討了牦牛血抗氧化肽在食品加工中的可能。研究結(jié)果如下:
　　枯草芽孢桿菌發(fā)酵牦牛血最佳發(fā)酵條件為:底物濃度75 g/L，接種量2.5％（V/V），發(fā)酵時(shí)間69.5 h。在該條件下制備的牦牛血抗氧化肽·OH清除率為74.48％，上清液多肽含量

3、為2.31 mg/mL。
　　篩選出堿性蛋白酶為酶解發(fā)酵液的最適蛋白酶，最佳酶解條件為:酶解時(shí)間3h、pH9.5、酶解溫度60℃和酶底比190 U/g。在該條件下制備的牦牛血抗氧化肽·OH清除率為93.62％，上清液多肽含量為5.52 mg/mL。
　　BF、AP、BA對·OH的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.73 mg/mL、7.40 mg/mL、3.61 mg/mL，對·O2-的IC50分別為8.42 mg/mL、12

4、.07 mg/mL、6.22 mg/mL，對脂質(zhì)過氧化的IC50分別為11.71 mg/mL、6.93 mg/mL、4.87 mg/mL，還原力大小為:BA＞BF＞AP。
　　利用超濾離心管將BA分離為分子量＞10 kDa、5 kDa～10 kDa、＜5 kDa三個(gè)組分，對·OH的IC50值分別為4.21 mg/ml、4.02 mg/ml、1.62 mg/ml。
　　利用凝膠層析法對分子量＜5 kDa的組分進(jìn)一步分離。考察洗

5、脫液、進(jìn)樣量、流速對分離效果的影響，得到凝膠層析最適條件為:以超純水為洗脫液，上樣量為0.4 mL，洗脫流速為0.2 mL/min。在此條件下，分離后得到4個(gè)組分，其中組分I的·OH清除能力最高，IC50值為0.72 mg/mL。
　　牦牛血抗氧化肽穩(wěn)定性研究表明，牦牛血抗氧化肽具有較好的耐熱性和耐堿性;當(dāng)pH值小于4時(shí)，抗氧化活性明顯下降。Zn2+和Cu2+會顯著降低其抗氧化活性(p＜0.05)，Ca2+在較高濃度下會抑制抗氧化