脂肪酶PaL和R-2-氯丙酸脫鹵酶dehDIV-R的結晶及手性識別過程研究.pdf

1、脂肪酶和脫鹵酶是水解酶中重要的兩大類。脂肪酶PaL能對四對外消旋薄荷醇丙酸酯進行選擇性水解得到三-薄荷醇，脫鹵酶dehDIV-R能對消旋2-氯丙酸進行選擇性水解從而得到光學純的S-2-氯丙酸，兩酶均具有重要的應用前景。但目前其蛋白結構尚未確定，手性識別過程也不明確，對其進行結構解析和手性識別研究具有重要意義。
　　首先利用已構建的重組菌（PaL菌株），可溶性表達脂肪酶PaL，并通過蛋白純化條件的篩選，利用親和鎳柱、Superdex

2、TM75 prep grade凝膠柱和GE MiniSPC3.2/3陽離子交換柱等進行層析法純化，得到高純度的蛋白;然后利用座滴氣相擴散法，在18℃和4℃初篩得到蛋白單晶。對18℃初篩的晶體進行優(yōu)化，最終在Tris-HCl(pH8.25)，PEG400032％，0.3％蔗糖，0.2 M NDSB-201條件下得到用于衍射的晶體。在結晶母液中添加10％的甘油作為冷凍保護液，在R-axis(Ⅳ)++(Rigaku)上收集數(shù)據，經HKL200

3、0處理后分辨率截取在2.5(A)，每一個不對稱單元含有兩個蛋白分子，空間群為P21212。然后利用單波長反常散射法(Se-MAD)解決晶體結構解析中的相角問題。在培養(yǎng)基中完全用硒代甲硫氨酸代替甲硫氨酸培養(yǎng)細菌以產生含硒代甲硫氨酸的蛋白質，達到硒取代硫的目的，得到的硒代蛋白采用母體蛋白相同的純化方式，再利用座滴氣相擴散法，在4℃初篩得到蛋白單晶。對初篩的晶體進行優(yōu)化，最終在PEG335024％，0.2 M檸檬酸鉀條件下得到質量較好的晶體。

4、在上海同步輻射光源(SSRF)的B17U線站上收集數(shù)據。經HKL2000處理后截取的分辨率為2.3(A)（圖2.17），每一個不對稱單元含有兩個蛋白分子，空間群仍然是P21212。但遺憾的是從HKL2000處理結果中未觀察到Se的反常散射信號。
　　接著本文利用已構建的重組菌（dehDIV-R菌株），可溶性表達脫鹵酶dehDIV-R，并通過蛋白純化條件的篩選，利用親和鎳柱、SuperdexTM75 prep grade凝膠柱和GE

5、 Mini QPC3.2/3陰離子交換柱等純化手段，得到高純度的蛋白;然后在4℃下利用座滴氣相擴散法進行初篩晶體，優(yōu)化后在0.1M Bis-Tris propane(pH8.5)，20％ PEG3350，0.2M氟化鈉條件下晶體質量有所改善。
　　最后以dehDIV-R為模型，研究了R-2-鹵代酸脫鹵酶的手性識別過程。首先通過測定反應產物的構型，確定dehDIV-R催化底物為SN2反應。通過DiscoveryStudio3.0對d