基因工程酶法高效再生ATP耦合生產(chǎn)谷胱甘肽.pdf

1、谷胱甘肽在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域以及美容方面都有廣泛應(yīng)用。一直以來(lái)關(guān)于谷胱甘肽的生產(chǎn)方法、分離手段等的研究層出不窮，但是關(guān)于怎么提高谷胱甘肽的產(chǎn)量，因?yàn)樯a(chǎn)條件限制、谷胱甘肽雙功能酶的產(chǎn)物抑制作用等原因，目前為止仍然是亟待解決的難題。
　　體外酶催化法生產(chǎn)谷胱甘肽的方法因?yàn)樯a(chǎn)過(guò)程容易調(diào)節(jié)相關(guān)的各個(gè)因素，所以是近年來(lái)廣泛研究的一種簡(jiǎn)單有效的生產(chǎn)方法，但是ATP供給問(wèn)題是該方法的一個(gè)重要的限制條件，所以體外酶法生產(chǎn)谷胱甘肽目前還不能很有

2、效的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
　　本課題針對(duì)上述兩個(gè)問(wèn)題分別進(jìn)行研究，得到了明確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:利用體外酶法耦合特定菌種來(lái)源的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成雙功能酶兩種酶，最終實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、高效率、低成本生產(chǎn)谷胱甘肽的目標(biāo)。課題中應(yīng)用的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成雙功能酶的來(lái)源是研究成功的關(guān)鍵因素。
　　課題的研究?jī)?nèi)容路線設(shè)計(jì)主要有以下幾點(diǎn):
　　(1)查閱文獻(xiàn)分別對(duì)比各種菌種來(lái)源的多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽合成雙功能酶(GS)的催化

3、效果和酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)，選擇對(duì)應(yīng)合適的基因ppk和gs。然后以選擇的合適基因片段為目的基因，構(gòu)建目的基因的重組載體，異源表達(dá)成功得到目的蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳法作為目的蛋白是否成功表達(dá)的檢測(cè)手段，驗(yàn)證ppk和gs對(duì)應(yīng)的催化酶PPK和GS的成功表達(dá)。
　　(2)用異源表達(dá)的高效低耗的多聚磷酸激酶(PPK)和產(chǎn)物抑制作用弱的谷胱甘肽合成雙功能酶(GS)做體外酶法耦合催化生產(chǎn)谷胱甘肽的嘗試。在初步嘗試成功的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)體系中

4、各物質(zhì)的濃度，確立影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素之后對(duì)反應(yīng)關(guān)鍵條件進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，最終得到耦合反應(yīng)的最適條件。優(yōu)化結(jié)果顯示，谷胱甘肽生產(chǎn)體系可以從30 mM擴(kuò)大到50mM;在優(yōu)化得到的反應(yīng)條件下，與同類(lèi)生產(chǎn)方法相比，GSH產(chǎn)量由8g·L-1提高到13 g·L-1，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化率為83.8％;與此同時(shí)，耦合反應(yīng)體系中外源ATP的加入量?jī)H為體系需求總量的20％?？傊?，與前人研究成果相比，本課題使谷胱甘肽產(chǎn)量提高1倍，同時(shí)反應(yīng)底物成本降低67.9％，這對(duì)于工業(yè)

5、生產(chǎn)谷胱甘肽是一個(gè)重大突破。
　　(3)在上述研究成果顯著的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大耦合催化反應(yīng)體積繼續(xù)進(jìn)行探索。首先對(duì)含有重組載體的菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，高壓勻漿破胞得到大量的粗酶液。以粗酶液為催化載體，擴(kuò)大耦合反應(yīng)體積到250mL。體積擴(kuò)大后耦合反應(yīng)生成的GSH濃度仍能達(dá)到12.32g·L-1，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化率為80.24％。
　　本課題的突破點(diǎn)在于，運(yùn)用Pasteurella multocida來(lái)源的谷胱甘肽合成雙功能酶GS產(chǎn)物抑制效應(yīng)弱