草魚LGP2和HMGB1b在抗GCRV感染過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)樣受體(RIG-Ⅰlikereceptors，RLRs)在感知RNA病毒感染和啟動抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化基因5(melanoma differentiation-associated gene，MDA5)是RLR家族兩個重要成員，它們負(fù)責(zé)識別病毒雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)并通過與干

2、擾素β啟動子激活因子1(IFN-βpromoter stimulator1，IPS-1)互作和翻譯后修飾來引起下游信號活化。但是對于RLR家族第三個成員遺傳學(xué)和生理學(xué)實驗室蛋白2(laboratory of genetics and physiology2，LGP2)來說，因缺少半胱天冬酶富集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)，使得LGP2不能招募信號傳導(dǎo)蛋白以引起下游信號的級聯(lián)放大。到目前為止，關(guān)

3、于LGP2的功能是有爭議的，因為既有關(guān)于其正調(diào)控的報道也有關(guān)于其負(fù)調(diào)控的報道。但是對于LGP2發(fā)揮兩種截然相反的功能的原因尚不清楚。尤其是在魚類中，目前還沒有充足的證據(jù)證明LGP2在RLR信號通路中的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　高遷移率族蛋白(high-mobi1ity group box protein，HMGB)是一類保守的染色質(zhì)相關(guān)蛋白，也是一類新的核酸識別分子。之前的研究表明，草魚(Ctenopharyngodon idella)HM

4、GB家族成員在草魚呼腸弧病毒(grass carp reovirus，GCRV)感染過程中發(fā)揮重要作用。由病毒感染和病原相關(guān)分子模式(pathogen-asociated molecular pattern，PAMP)刺激引起的HMGB動態(tài)亞細(xì)胞定位是受HMGB分子內(nèi)不同結(jié)構(gòu)域間相互作用調(diào)控的。然而，對于HMGB在抗病毒免疫中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
　　在本研究中，我們對GCRV感染過程中，LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5調(diào)節(jié)的抗病毒

5、免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了研究。同時我們也鑒定了熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)作為HMGB1b的互作蛋白，并證明了HSP70在HMGB1b調(diào)節(jié)的抗病毒自噬中的正調(diào)控作用。
　　1.在靜息狀態(tài)下和GCRV感染早期，LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5調(diào)節(jié)的抗病毒信號傳導(dǎo)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用
　　在本研究中，我們證明，在靜息狀態(tài)下或病毒感染早期，LGP2過表達(dá)抑制了干擾素調(diào)節(jié)因子(interfero

6、n regulatory factor,IRF)3和7的蛋白合成和磷酸化水平。同時，LGP2過表達(dá)也抑制了所有干擾素(interferon，IFN)家族成員(IFN1、IFN2、IFN3、IFN4、IFNγ1、IFNγ2)和核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)家族成員(NF-κB1、NF-κB2)的mRNA水平和啟動子活性。敲降LGP2之后得到了相反的效應(yīng)。雙熒光素酶報告試驗表明，LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5上游

7、發(fā)揮作用。同時，LGP2能與RIG-Ⅰ和MDA5相互作用，并且這種相互作用是不依賴于GCRV感染的。結(jié)構(gòu)域互作試驗發(fā)現(xiàn)，LGP2與MDA5的三個結(jié)構(gòu)域都互作。但不與RIG-Ⅰ的CARD結(jié)構(gòu)域互作。此外，LGP2對RIG-Ⅰ和MDA5的K63連接的泛素化有明顯的抑制作用，但對RIG-Ⅰ和MDA5的CARD結(jié)構(gòu)域來說，LGP2過表達(dá)只顯著抑制了RIG-Ⅰ的CARD結(jié)構(gòu)域K63連接的泛素化，而對MDA5CARD結(jié)構(gòu)域的K63鏈接的泛素化沒有影

8、響。這種差異導(dǎo)致了LGP2在RIG-Ⅰ和MDA5調(diào)節(jié)的IPS-1和IRF3活化調(diào)節(jié)因子(mediator ofIRF3activation，MITA)活化中的不同抑制機(jī)制。有意思的是，LGP2對RIG-Ⅰ和MDA5的K48連接的泛素化也有抑制作用。我們推測這種抑制作用保證了RIG-Ⅰ和MDA5的基礎(chǔ)蛋白水平，為隨后信號的迅速活化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。以上結(jié)果表明，在靜息狀態(tài)下或病毒感染早期，LGP2在RLR信號通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，這是機(jī)體維

9、持穩(wěn)態(tài)所必須的。
　　2.GCRV感染后，HSP70通過與HMGB1b互作、引起HMGB1b的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、以及增強(qiáng)HMGB1b-Beclin1相互作用來促進(jìn)HMGB1b調(diào)節(jié)的抗病毒自噬
　　自噬在病理和生理過程中發(fā)揮著重要作用。然而，在魚類中，人們對自噬在應(yīng)對病毒感染中所扮演的角色及其調(diào)控機(jī)制的研究卻很少。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GCRV感染和雙氧水(hydrogen peroxide，H2O2)處理引起了CIK(C.idella

10、 kidney，CIK)細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累以及隨后的自噬活化。而ROS引起的自噬反過來抑制了病毒復(fù)制。進(jìn)一步的研究表明HMGB1b是一個HSP70依賴的促自噬蛋白。在H2O2處理后，胞質(zhì)定位的HSP70轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核并在細(xì)胞核中與HMGB1b互作，進(jìn)而促進(jìn)了HMGB1b的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。在胞質(zhì)中，HSP70與HMGB1b協(xié)同增強(qiáng)ROS引起的自噬活化。而且，HSP70通過與Beclin1的