黃曲霉毒素廣譜特異性抗體的制備及總量檢測免疫試紙方法的建立.pdf

1、黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是由曲霉菌屬產(chǎn)生的具有毒性作用的次生代謝產(chǎn)物。AF對人體健康具有急性、慢性、致癌性、免疫抑制等多種毒性危害作用，自然條件下產(chǎn)生的AF主要包括B1、B2、G1、G24種，且這4種毒素殘留對人體健康的毒性往往具有協(xié)同和加性效應(yīng)，實施黃曲霉毒素總量（total aflatoxins，TAFs）（B1＋B2＋G1＋G2）檢測已成為當前食品質(zhì)量安全檢測領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢。比較各種TAFs檢測方法，GICA技術(shù)

2、具有快速、簡便、特異性強、穩(wěn)定性好、可現(xiàn)場檢測、篩檢樣品量大等優(yōu)勢，是實現(xiàn)TAFs檢測的主要技術(shù)手段。本研究的目是建立TAFs免疫試紙檢測方法，為食品TAFs快速檢測提供可靠的技術(shù)支撐。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)AF的分子結(jié)構(gòu)和活性位點，設(shè)計出4種B族AF和3種G族AF抗原制備方法，通過UV、SDS-PAGE和動物免疫對抗原進行鑒定。結(jié)果表明，OAE法是B族AF抗原合成的最佳方法，AFB1與BSA的分子結(jié)合比為8.46∶1，

3、動物免疫所產(chǎn)生AFB1 pAb具有高效價（免疫動物易產(chǎn)生抗體）、敏感（IC50為17.03μg/kg）、特異（100%識別AFB1）、廣譜（同時100%識別AFB2）等特性；SA法是G族AF抗原合成的最佳方法，AFG1與BSA的分子結(jié)合比為4.32∶1，動物免疫所產(chǎn)生AFG1 pAb同樣具有高效價（免疫動物易產(chǎn)生抗體）、敏感（IC50為13.6μg/kg）、特異（100%識別AFG1）、廣譜（與AFG2的交叉反應(yīng)率為82.19%）等特性

4、。⑵分別用AFB1-BSA（OAE）和AFG1-BSA（SA）免疫Balb/C小鼠，細胞融合技術(shù)篩選AFB1 mAb和AFG1 mAb細胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備AFB1 mAb和AFG1 mAb，并對其免疫學(xué)特性進行分析。結(jié)果表明，篩選出AFB1 mAb細胞株4株，其中2A11最好，經(jīng)9次傳代分泌抗體穩(wěn)定，細胞培養(yǎng)上清抗體效價1∶（1.28×103），腹水抗體效價為1∶（5.12×105），Ka為1.05×109 L/moL，IC50為

5、6.22μg/kg，可100%識別AFB1，與AFB2、AFG1和AFG2交叉反應(yīng)率（cross-reactivity，CR）分別為82.31%、50.11%和12.48%，制備出了效價高、敏感性好、特異性強AFB1 mAb；篩選出AFG1 mAb細胞株2株，其中3F10最好，經(jīng)6次傳代分泌抗體穩(wěn)定，細胞培養(yǎng)上清抗體效價1∶（1.28×104），腹水抗體效價為1∶（5.12×105），Ka為1.36×1010 L/moL，IC50為5.

6、04μg/kg，可100%識別AFG1，與AFG2的CR%為85.81%，與AFB1、AFB2無CR，制備出了效價高、敏感性好、特異性強AFG1 mAb，研究結(jié)果為AFs免疫試紙檢測方法的建立奠定了抗體基礎(chǔ)。⑶根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)原理，建立了TAFs免疫試紙（TAFs-Strip）檢測方法，TAFs-Strip具有快速（10 min）、靈敏（4μg/L）、特異（只與AF反應(yīng)，與其他化合物無CR）、廣譜（可同時檢測AFB1、B2、G1、