黃曲霉毒素M1單克隆抗體及檢測技術研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是由真菌產生的一組結構類似的次生代謝產物,具有高毒性和強致癌性,已被國際癌癥研究機構列為一類致癌物質。其中黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料后,經體內羥基化生成,并分泌到乳汁中。因此AFM1廣泛存在于乳及乳制品中。隨著飲食結構的調整,乳及乳制品中AFM1的存在對人類,尤其是嬰幼兒的危害引起了廣泛關注。世界各國設置了嚴格限量標準,同時也造成

2、技術貿易壁壘(TechnicalBarriers to Trade,TBT)。傳統(tǒng)的AFM1檢測技術由于需要使用大量標準品和有機溶劑,不僅危害操作人員的身體健康,同時也會對環(huán)境造成二次污染,因此需要發(fā)展安全、環(huán)境友好的檢測技術來保障人民消費安全。本論文主要研究方法和結論如下:
　　 1.以AFM1-BSA為免疫原,微量抗原乳化裝置乳化后免疫Balb／c小鼠,通過細胞融合技術,半固體培養(yǎng)基法篩選獲得一株分泌抗AFM1抗體單克隆細胞

3、株,命名為2C9。2C9分泌的單克隆抗體(Monoclonal antibody,Mab)親和力常數(shù)達到1.74×109L／mol;亞型為IgG2a型；與黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2均無交叉反應,為目前報道的特異性最好的AFM1單克隆抗體。高質量單克隆抗體的獲得,為進一步研究AFM1免疫檢測技術奠定了基礎。
　　 2.以單克隆抗體2C9為基礎,研究建立了乳及嬰幼兒乳制品中AFM1超靈敏間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(Enzym

4、e-linked immunosorbent assay,ELISA)。其中包被抗原AFM1-BSA的濃度為0.0625μg／mL,2C9單克隆抗體稀釋度為1:10000。通過對pH值、鹽離子濃度、封閉物等理化參數(shù)的優(yōu)化,該檢測技術對乳及乳粉中AFM1的檢測限(Limit of detection,LOD)為3 ng／L,對嬰幼兒乳制品中的LOD為6 ng／L?；厥章史秶?1～110％之間,批內和批間變異系數(shù)均小于10％。實際樣品測定

5、結果與國家標準方法測定結果相比具有良好的相關性。超靈敏AFM1檢測技術的建立,為保障乳及嬰幼兒乳制品的安全消費提供有力技術支撐。
　　 3.針對ELISA檢測中AFM1標準品危害操作人員健康、污染環(huán)境的問題,本研究將抗獨特型抗體作為標準品替代物,應用于AFM1綠色分析技術中。胃蛋白酶法酶切抗AFM1單克隆抗體制備F(ab')2片斷,經免疫新西蘭大白兔,獲得AFM1抗獨特型抗體。該抗獨特型抗體與其它黃曲霉毒素單克隆抗體以及相同亞型

6、對照抗體均無交叉反應,只與抗AFM1單克隆抗體結合。通過在同一抑制率下濃度的比較,發(fā)現(xiàn)抗獨特型抗體與AFM1之間存在非常好的線性關系。將抗獨特型抗體作為替代標準品應用到ELISA檢測當中,回收率范圍在85.2～110.9％之間,批內和批間變異系數(shù)均小于10.8％。實際樣品的測定結果與國家標準方法相比,相關性系數(shù)達到0.9922。
　　 4.非標記二抗可與酶標二抗競爭結合一抗的共有位點,以非標記二抗作為競爭物應用于黃曲霉毒素ELI

7、SA反應中,研究發(fā)現(xiàn)該競爭曲線與黃曲霉毒素標準曲線之間線形相同,趨勢一致。通過進一步研究同一抑制率下濃度的對應關系,發(fā)現(xiàn)非標記二抗與黃曲霉毒素之間均呈現(xiàn)非常好的相關性,具有穩(wěn)定的函數(shù)關系。因此,提出非標記二抗作為黃曲霉毒素通用替代物的新模式。通過對識別位點、樣品添加回收率的研究,證明了非標記二抗能夠作為黃曲霉毒素通用替代標準品應用于ELISA檢測之中。
　　 5.以免疫親和層析凈化濃縮,ASPEC XL全自動固相萃取儀實現(xiàn)樣品自

8、動處理,半導體二級管激光器作為激發(fā)光源誘導熒光,建立了牛奶中AFM1快速高靈敏篩查技術。通過免疫親和柱凈化濃縮作用,激光光源提高入射光強度,大大提高了檢測靈敏度,牛奶中AFM1的LOD為2.3 pg／mL,定量限(Limit of quantitation,LOQ)為24.7 pg／mL,避免了化學衍生劑的使用,縮短了檢測時間,增加了檢測穩(wěn)定性。對50、100、500 pg／mL三個濃度的添加回收范圍在87～106％之間,相對標準偏差小