黃曲霉毒素M1單克隆抗體及檢測技術(shù)研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是由真菌產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物,具有高毒性和強(qiáng)致癌性,已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一類致癌物質(zhì)。其中黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料后,經(jīng)體內(nèi)羥基化生成,并分泌到乳汁中。因此AFM1廣泛存在于乳及乳制品中。隨著飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整,乳及乳制品中AFM1的存在對人類,尤其是嬰幼兒的危害引起了廣泛關(guān)注。世界各國設(shè)置了嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn),同時也造成

2、技術(shù)貿(mào)易壁壘(TechnicalBarriers to Trade,TBT)。傳統(tǒng)的AFM1檢測技術(shù)由于需要使用大量標(biāo)準(zhǔn)品和有機(jī)溶劑,不僅危害操作人員的身體健康,同時也會對環(huán)境造成二次污染,因此需要發(fā)展安全、環(huán)境友好的檢測技術(shù)來保障人民消費(fèi)安全。本論文主要研究方法和結(jié)論如下:
　　 1.以AFM1-BSA為免疫原,微量抗原乳化裝置乳化后免疫Balb／c小鼠,通過細(xì)胞融合技術(shù),半固體培養(yǎng)基法篩選獲得一株分泌抗AFM1抗體單克隆細(xì)胞

3、株,命名為2C9。2C9分泌的單克隆抗體(Monoclonal antibody,Mab)親和力常數(shù)達(dá)到1.74×109L／mol;亞型為IgG2a型；與黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2均無交叉反應(yīng),為目前報道的特異性最好的AFM1單克隆抗體。高質(zhì)量單克隆抗體的獲得,為進(jìn)一步研究AFM1免疫檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.以單克隆抗體2C9為基礎(chǔ),研究建立了乳及嬰幼兒乳制品中AFM1超靈敏間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(Enzym

4、e-linked immunosorbent assay,ELISA)。其中包被抗原AFM1-BSA的濃度為0.0625μg／mL,2C9單克隆抗體稀釋度為1:10000。通過對pH值、鹽離子濃度、封閉物等理化參數(shù)的優(yōu)化,該檢測技術(shù)對乳及乳粉中AFM1的檢測限(Limit of detection,LOD)為3 ng／L,對嬰幼兒乳制品中的LOD為6 ng／L?；厥章史秶?1～110％之間,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10％。實(shí)際樣品測定

5、結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定結(jié)果相比具有良好的相關(guān)性。超靈敏AFM1檢測技術(shù)的建立,為保障乳及嬰幼兒乳制品的安全消費(fèi)提供有力技術(shù)支撐。
　　 3.針對ELISA檢測中AFM1標(biāo)準(zhǔn)品危害操作人員健康、污染環(huán)境的問題,本研究將抗獨(dú)特型抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品替代物,應(yīng)用于AFM1綠色分析技術(shù)中。胃蛋白酶法酶切抗AFM1單克隆抗體制備F(ab')2片斷,經(jīng)免疫新西蘭大白兔,獲得AFM1抗獨(dú)特型抗體。該抗獨(dú)特型抗體與其它黃曲霉毒素單克隆抗體以及相同亞型

6、對照抗體均無交叉反應(yīng),只與抗AFM1單克隆抗體結(jié)合。通過在同一抑制率下濃度的比較,發(fā)現(xiàn)抗獨(dú)特型抗體與AFM1之間存在非常好的線性關(guān)系。將抗獨(dú)特型抗體作為替代標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用到ELISA檢測當(dāng)中,回收率范圍在85.2～110.9％之間,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10.8％。實(shí)際樣品的測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比,相關(guān)性系數(shù)達(dá)到0.9922。
　　 4.非標(biāo)記二抗可與酶標(biāo)二抗競爭結(jié)合一抗的共有位點(diǎn),以非標(biāo)記二抗作為競爭物應(yīng)用于黃曲霉毒素ELI

7、SA反應(yīng)中,研究發(fā)現(xiàn)該競爭曲線與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線之間線形相同,趨勢一致。通過進(jìn)一步研究同一抑制率下濃度的對應(yīng)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)非標(biāo)記二抗與黃曲霉毒素之間均呈現(xiàn)非常好的相關(guān)性,具有穩(wěn)定的函數(shù)關(guān)系。因此,提出非標(biāo)記二抗作為黃曲霉毒素通用替代物的新模式。通過對識別位點(diǎn)、樣品添加回收率的研究,證明了非標(biāo)記二抗能夠作為黃曲霉毒素通用替代標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于ELISA檢測之中。
　　 5.以免疫親和層析凈化濃縮,ASPEC XL全自動固相萃取儀實(shí)現(xiàn)樣品自

8、動處理,半導(dǎo)體二級管激光器作為激發(fā)光源誘導(dǎo)熒光,建立了牛奶中AFM1快速高靈敏篩查技術(shù)。通過免疫親和柱凈化濃縮作用,激光光源提高入射光強(qiáng)度,大大提高了檢測靈敏度,牛奶中AFM1的LOD為2.3 pg／mL,定量限(Limit of quantitation,LOQ)為24.7 pg／mL,避免了化學(xué)衍生劑的使用,縮短了檢測時間,增加了檢測穩(wěn)定性。對50、100、500 pg／mL三個濃度的添加回收范圍在87～106％之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小