抗NMDAR2B(phospho Y1070)兔單克隆抗體制備及初步鑒定.pdf

1、背景：抗體從多克隆發(fā)展到單克隆抗體藥物，已被廣泛應(yīng)用于生物科學及醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)產(chǎn)品中。相比鼠單克隆抗體而言，兔單克隆抗體具有高親和力，特異性強，易于人源化等優(yōu)點。n-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDARs)是壓力敏感型和配基偶聯(lián)的鈣離子通道，并在突觸可塑性、學習記憶以及神經(jīng)紊亂等方面扮演重要角色，作為一種獨特的雙重門控通道(doubly gated channel)，它既受膜電位控制也受其它神經(jīng)遞質(zhì)控制。該受體被激活后，主要對Ca2+有通透

2、性，介導(dǎo)持續(xù)、緩慢的去極化過程。目前市面上主要是NMDAR2B的多克隆抗體，且其特異性和親和力并不是十分理想。
　　目的：制備NMDAR2B兔單克隆抗體。
　　方法：本實驗設(shè)計合成了一段NMDAR2B多肽，YCA-13436多肽免疫三只實驗兔。經(jīng)過血清blot實驗初步篩選，將可能免疫了NMDAR2B兔脾細胞與240E兔骨髓瘤樣細胞株融合，產(chǎn)生能分泌NMDAR2B抗體的兔-兔雜交瘤細胞，用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對融合后的細胞進

3、行培養(yǎng)，運用ELISA法和WB法，篩選獲得陽性克隆，選取其中WB信號最強的克隆進入抗體質(zhì)粒重組階段，再進一步篩選，選取分泌單克隆抗體最強的配對進入單克隆抗體大轉(zhuǎn)生產(chǎn)。
　　結(jié)果：YCA-13436的H1332號兔子免疫效果較佳，并進入融合開發(fā)抗體，所得重組37-d抗體在多種裂解液中檢出特異性目的條帶，并能特異性地識別磷酸化蛋白而不能識別非磷酸化蛋白。
　　結(jié)論：本實驗共設(shè)計一段NMDAR2B的磷酸化氨基酸序列，編號是YCA-