7-脫氫膽固醇生物合成釀酒酵母的構建和后鯊烯路徑的研究.pdf

1、7-脫氫膽固醇(7-DHC)作為合成維生素D3的重要前體，有著廣泛的醫(yī)藥和臨床應用。本研究將外源基因C-24還原酶(DHCR24)導入釀酒酵母中，成功實現了7-脫氫膽固醇的異源合成。
　　將功能外源基因C24位雙鍵還原酶DHCR24分別導入固醇C-24甲基轉移酶（ERG6）或固醇C-22脫氫酶（ERG5）的單敲酵母菌株中，結合內源tHMGR的過表達來增加前體量，最終可獲得7-DHC的人工生產菌株。外源基因DHCR24模塊的導入實現

2、了產物的從零到有。上游內源基因tHMGR基因的過表達雖然會導致鯊烯的大量積累，但會給后續(xù)固醇合成提供前體物，使產量大幅提高。敲除ERG6的菌株較ERG5敲除菌株而言，雖然生長趨勢略差但會直接增加代謝底物酵母固醇的積累，使固醇整體水平處于較高狀態(tài)，利于產物生成。最終底盤細胞與內外源模塊相互配合，使得人工合成菌株的產量為3.4mg/L。
　　進一步針對7-DHC合成路徑中的后鯊烯路徑內源基因進行比較，用固醇類物質的變化來研究7-DHC

3、合成路徑的內源關鍵基因。發(fā)酵結果表明，后鯊烯路徑內源基因ERG2-ERG3的聯合過表達使得7-DHC的產量有略微提高。原因在于ERG2-3位于酵母固醇的下游，對7-DHC的合成起了推動作用。通過產物差異性的比較，推斷了一系列未知的固醇類物質，證明了DHCR24的底物非特異性。各類物質相對含量的變化證實了后鯊烯路徑內源基因模塊對整體固醇相對含量的變化及固醇總量的調節(jié)作用，結合PCA分析后，得出一致性結論:調節(jié)后鯊烯路徑基因模塊會引起明顯的

4、固醇成分差異，但其中最顯著影響的是ERG11單基因模塊和ERG2-3組合模塊。ERG11和ERG2-ERG3是7-DHC合成路徑上的關鍵基因模塊。
　　針對生物體內底物復雜，產物生成后分離純化困難等問題，探索體外生物反應體系。首先以兩個已知外源基因LXYL-P1-2和DBAT為例，試驗PURESystem無細胞轉錄/翻譯偶聯體外表達體系。DNA片段加入體系后成功檢測到了各蛋白的表達。同時，將兩基因在大腸桿菌中表達，之后直接利用細胞