用于生物合成谷胱甘肽的重組大腸桿菌—釀酒酵母耦合系統(tǒng)的高效運行機制.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)是廣泛存在于動物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的一種小分子巰基化合物，具有維持胞內(nèi)氧化還原平衡的功能，影響許多重要的生理功能，例如：基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等。近年來，GSH廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等工業(yè)，其商業(yè)需求量日益增加。
　　 谷胱甘肽在生物體內(nèi)是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSHI)和GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSHⅡ)在ATP存在的條件下，催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨

2、酸進(jìn)行序貫反應(yīng)而合成的。相比于發(fā)酵法生產(chǎn)GSH，酶法合成GSH可以獲得更高的產(chǎn)物濃度，也更有利于下游的分離純化。然而，到目前為止酶法合成GSH尚未實現(xiàn)工業(yè)化。一方面，GSH的合成伴隨著ATP的消耗(合成1MGSH需消耗2MATP)，由于ATP價格昂貴，直接添加ATP顯著增加了酶法合成GSH的成本，并且高濃度的ATP及其代謝產(chǎn)物ADP的存在還會強烈抑制GSH合成酶的活性；另一方面，酶法合成GSH需要高酶活性的GSH合成酶系(GSHI和GS

3、HⅡ)，野生型菌株通常不具備這一條件。本研究成功構(gòu)建了一個由重組大腸桿菌(Escherichia coli)△add/ade/pepT(pBV03)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WSH2組成的種間耦合系統(tǒng)。在該耦合系統(tǒng)中，以腺苷(Ado)為底物建立了ATP合成和利用的循環(huán)反應(yīng)，藉此對耦合系統(tǒng)中的ATP再生機制進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)耦合系統(tǒng)中GSH產(chǎn)量隨著ATP再生效率的增加而顯著提高。同時，確定了E.col

4、i中降解GSH的關(guān)鍵酶，在此基礎(chǔ)上通過基因敲除和培養(yǎng)條件優(yōu)化相結(jié)合的手段消除了E.coli對GSH的降解能力。最后，考察了一種可以避免傳統(tǒng)物理和化學(xué)處理方式的不足并且操作簡便的新細(xì)胞通透處理方式在酶法合成GSH中的應(yīng)用。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)構(gòu)建了一株腺苷脫氨酶基因(add)缺失的重組大腸桿菌(E.coli JW1615)，考察了add基因缺失對E.coli中ATP代謝的影響。腺苷脫氨酶(ADA)的缺失可以完全阻斷Ad

5、o向肌苷(Ino)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而顯著降低Ado(或ATP)不可逆轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤(Hx)的速度，因此ATP被E.coli JW1615利用來合成GSH之后的主要代謝產(chǎn)物為Ado和腺嘌呤(Ade)。進(jìn)一步的研究表明S.cerevisiae WSH2可以利用Ado和Ade合成ATP。因此在重組E.coliJW1615(pBV03)和S.cerevisiae WSH2組成的耦合系統(tǒng)中，GSH的產(chǎn)量顯著提高，達(dá)到7.82mM，該產(chǎn)量為野生型菌株E.

6、coliBW25113(pBV03)和S.cerevisiae WSH2組成的耦合系統(tǒng)的2.94倍。在新構(gòu)建的耦合系統(tǒng)中，建立了ATP合成和利用反應(yīng)的循環(huán)，然而，在該耦合系統(tǒng)中仍檢測到少量Hx的生成。由KEGG的代謝途徑可知，Ado可以經(jīng)過兩條途徑轉(zhuǎn)化為Hx：一條途徑是Ado經(jīng)Ino轉(zhuǎn)化為Hx，另一條途徑為Ado經(jīng)Ade生成Hx。在野生型菌株中Ado經(jīng)Ade生成Hix的途徑幾乎是關(guān)閉的，只有在另一條途徑被切斷后其作用方能體現(xiàn)出來。結(jié)果表

7、明，Ado經(jīng)Ino轉(zhuǎn)化為Hix是Hx的主要生成途徑，但是僅僅敲add基因只能顯著減少卻無法完全阻斷Hx的生成。
　　 (2)腺苷脫氨酶基因(add)和腺嘌呤脫氨酶基因(ade)的同時缺失可以完全切斷E.coli中ATP向Hx的不可逆轉(zhuǎn)化，ATP的主要代謝產(chǎn)物為Ado和Ade，如前文所述這兩種底物都可以被S.cerevisiae利用來再生ATP。因此，由E.coli△add/ade(pBV03)和S.cerevisiae WSH2

8、組成的耦合系統(tǒng)在6h內(nèi)生成10.88mMGSH，這是對照耦合系統(tǒng)(由野生型E.coli BW25113構(gòu)建的耦合系統(tǒng))的4.03倍，相比于由E.coli JW1615(pBV03)構(gòu)建的耦合系統(tǒng)提高了39.1％。綜上所述，降低E.coli不可逆轉(zhuǎn)化ATP為Hx的能力可以顯著提高耦合系統(tǒng)的ATP再生效率，耦合系統(tǒng)合成GSH的能力也隨之增強。因此，導(dǎo)致由野生型E.coli構(gòu)建的耦合系統(tǒng)無法高效運行的根本原因是其再生ATP的效率低，而不是如M

9、urata等報道的是由于ATP的利用效率低而造成的。
　　 (3)通過敲除可能與降解GSH相關(guān)的酶基因，考察了單基因缺失對E.coli降解GSH的影響。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)和三肽酶(PepT)是降解GSH的關(guān)鍵酶，敲除這兩種酶的基因都可以明顯降低E.coli對GSH的降解能力，敲除γ-GGT基因的作用效果比敲除PepT更強。由于在本研究所構(gòu)建的反應(yīng)體系中缺少底物可以結(jié)合谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)從GSH分子中轉(zhuǎn)移的硫原

10、子，因此GST不是本研究中降解GSH的關(guān)鍵酶。此外，菌體培養(yǎng)的溫度嚴(yán)重影響γ-GGT的酶活性，其降解作用可以通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來消除，因而在本研究構(gòu)建的反應(yīng)體系中不需要通過敲除γ-GGT基因來消除其對GSH的降解作用，然而PepT的酶活性不受培養(yǎng)溫度的影響，只有敲除其基因才能消除其對GSH的降解作用。實驗表明，由于同時消除了γ-GGT和PepT這兩個關(guān)鍵酶的作用，在PepT基因缺失的重組E.coli JW1113(pBV03)生物合成GS

11、H的過程中GSH幾乎不發(fā)生降解，該菌體的培養(yǎng)條件為30℃下培養(yǎng)3h然后經(jīng)42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。
　　 (4)成功構(gòu)建了一株布朗氏脂蛋白(lpp)基因缺失的重組大腸桿菌(E.coli JW1667)。lpp基因缺失沒有明顯降低菌體的生長代謝。在未進(jìn)行其他細(xì)胞通透性處理的條件下，lpp基因缺陷型菌株E.coli JW1667(pBV03)生物合成GSH的速度及其合成量都明顯高于野生型菌株E.coli BW25113(pBV03)，反應(yīng)

12、1h時，E.coli JW1667(pBV03)合成了12.66mMGSH，其合成量為對照菌株的5.75倍。由此可知，lpp基因缺失可以明顯提高E.coli細(xì)胞通透性，進(jìn)而提高其生物合成GSH的能力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了lpp基因敲除和甲苯直接處理對重復(fù)利用E.coli細(xì)胞生物合成GSH的影響。在用于首次合成時，兩者合成GSH的能力相當(dāng)，隨著重復(fù)反應(yīng)次數(shù)的增加，兩者合成GSH的能力都略有下降，但是甲苯直接處理的細(xì)胞下降趨勢更大，表明

13、其對細(xì)胞完整結(jié)構(gòu)的破壞更大。第五次反應(yīng)時，甲苯直接處理的細(xì)胞合成GSH的能力相比于初次合成下降了22.1％，而lpp基因敲除的細(xì)胞合成GSH的能力僅下降了11.0％。綜上所述，lpp基因敲除可以作為一種新的E.coli細(xì)胞通透性處理策略，避免了傳統(tǒng)物理和化學(xué)處理方式的不足，并簡化了細(xì)胞通透性處理的過程。
　　 (5)通過分析由重組E.coli△add/ade/pepT(pBV03)和S.cerevisiae WSH2組成的耦合系

14、統(tǒng)中ATP的代謝情況，發(fā)現(xiàn)在該耦合系統(tǒng)中依然存在著從ATP到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化。如前文所述在E.coli△add/ade/pepT(pBV03)中該轉(zhuǎn)化途徑已經(jīng)完全切斷，因此該不可逆轉(zhuǎn)化只能是由S.cerevisiae WSH2引起的。為此，檢測了S.cerevisiae WSH2對外加Ado和Ade的代謝產(chǎn)物。反應(yīng)2h后，約88％的底物Ado被S.cerevisiae WSH2利用來合成ATP，反應(yīng)體系中檢測不到Ino、Hx和Ade的生

15、成，此結(jié)果表明在S.cerevisiae WSH2中KEGG報道存在的腺苷脫氨酶并未發(fā)生作用，并且S.cerevisiae WSH2中也不存在從Ado到Ade的代謝途徑。然而，以Ade為底物反應(yīng)2h后，反應(yīng)體系中除了檢測到ATP、ADP和AMP外還檢測到大量Hx和Ino。由此可知，耦合系統(tǒng)中的積累的Hx是由S.cerevisiae WSH2中的腺嘌呤脫氨酶(ADE)代謝Ade產(chǎn)生的。抑制S.cerevisiae WSH2中ADE的酶活性

16、可以明顯降低從Ade到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高耦合系統(tǒng)中的ATP再生效率和GSH合成能力。此外，通過推遲重組E.coli△add/ade/pepT(pBV03)參與耦合的時間也可提高耦合系統(tǒng)合成GSH的能力。一方面，通過推遲重組E.coli耦合時間，S.cerevisiae WSH2可更多的利用初始底物Ado合成ATP；另一方面，對于重組E.coli△add/ade/pepT(pBV03)，由于腺苷脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶的缺失完全切斷了