雌二醇,皮質(zhì)醇對團頭魴垂體糖蛋白激素a亞基基因表達的影響及其基因啟動子缺失表達載體的構(gòu)建.pdf

1、本論文首先運用RACE方法克隆得到了團頭魴(Megalobrama amblycephala)垂體糖蛋白激素α亞基(PGPHα)cDNA全長，并對其序列進行了分析。然后運用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的方法檢測了外源性雌二醇(E2)，皮質(zhì)醇(Cortisol)對團頭魴PGPHα亞基基因表達的影響。實驗設(shè)計：實驗分為57％酒精注射對照組，雌二醇(0.5mg/kg體重)注射實驗組和皮質(zhì)醇(0.2mg/kg體重)注射實驗組(兩種激素均

2、以57％的酒精作為溶劑)，同時還設(shè)立了空白實驗組。實驗每兩周注射一次，注射2次和4次后的第3天取樣。最后，為進一步探討團頭魴PGPHα亞基基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，本文運用PCR-末端加尾法克隆了團頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列，并在進行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列的缺失表達載體。本論文的完成，填補了從基因水平研究團頭魴PGPHα亞基的空白，為基因重組型團頭魴“全魚”促性腺激素及其類似物的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時為健康養(yǎng)殖及環(huán)

3、境保護相關(guān)法律法規(guī)的制定提供科學(xué)依據(jù)。此外，根據(jù)實驗結(jié)果，本論文還提出了皮質(zhì)醇導(dǎo)致魚類繁殖力下降的可能的分子機制。
　　 1.團頭魴PGPHα亞基cDNA的克隆和序列分析
　　 運用RACE法克隆得到了團頭魴PGPHα亞基cDNA全長序列。該cDNA全長859bp，包括45 bp的5’端非翻譯區(qū)，427bp的3’端非翻譯區(qū)，357 bp的開放閱讀框(ORF)以及30bp的PolyA序列，加尾信號ATTAAA位于807bp

4、處。團頭魴PGPHα亞基ORF區(qū)編碼了118個氨基酸，包括23個氨基酸殘基的信號肽序列及95個氨基酸殘基的成熟肽序列。序列分析結(jié)果顯示：團頭魴PGPHα亞基的氨基酸序列與草魚(Ctenopharyngodon idella)的同源性最高，為100％；其次為鯉魚、鰱魚，同源性均達到98.9％；與庸鰈的同源性最低，但氨基酸序列的相似性也達到58％。由此表明，PGPHα亞基在長期的進化過程中具有很高的保守性。團頭魴PGPHα亞基的核酸與氨基酸

5、序列與鯉科魚類的相應(yīng)序列顯示出很高的同源性，表明其親緣關(guān)系非常接近，與根據(jù)已知魚類PGPHα亞基氨基酸序列所做的進化分析結(jié)果一致，也符合目前公認的分類關(guān)系。此外，在PGPHα亞基成熟肽序列中存在10個高度保守的半胱氨酸殘基，2個保守的N-糖基化位點以及三個高度保守的脯氨酸殘基。
　　 2.外源性雌二醇，皮質(zhì)醇對團頭魴PGPHα亞基基因表達的影響
　　 運用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法分析了外源性皮質(zhì)醇和雌二醇

6、對團頭魴PGPHα亞基基因表達的影響。實驗設(shè)計為8周，實驗組每兩周分別注射一次0.2 mg/kg體重的皮質(zhì)醇以及0.5 mg/kg體重的雌二醇(均用57％酒精溶解)，對照組注射同劑量的57％酒精，同時設(shè)置了空白實驗組。實驗期間沒有投喂飼料。在本實驗條件下，研究結(jié)果顯示：注射2次與注射4次雌二醇對團頭魴PGPHα亞基基因表達無顯著影響。注射2次皮質(zhì)醇后，PGPHα亞基的表達出現(xiàn)下降的趨勢，但與對照組相比無顯著差異；注射4次后，PGPHα亞

7、基表達量降低，且與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；另外，對照組與空白實驗組相比，PGPHα亞基基因的表達量無顯著差異，表明實驗操作并未對團頭魴PGPHα亞基基因表達造成顯著的影響。
　　 3.團頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列克隆及其表達載體的構(gòu)建
　　 首先運用PCR-末端加尾法克隆了團頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列；然后利用生物信息學(xué)理論對該序列進行了序列分析；最后在序列分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了熒光素

8、酶質(zhì)粒表達載體。序列分析結(jié)果顯示：克隆所得到的團頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列長1399bp；其序列中包含潛在的TATA盒、GC盒，以及ERE、TRE、CRE、PGBE等對PGPHα亞基基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用的功能轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；啟動子區(qū)域位于-40～10bp處。利用PCR方法擴增得到了全長-1399～+40bp以及-1080～+40bp、-492～+40bp、-133-+40bp的缺失片段，并將其連接至pGL3-Basic報告