食品中致病菌IMBs-qPCR法快速檢測技術(shù)的研究.pdf

1、食源性致病菌是引起食源性疾病的最主要因素，也是影響食品安全的重要隱患。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前大多數(shù)國家檢驗食源性致病菌普遍采用的方法，其程序繁瑣、耗時費力，檢測結(jié)果在準確性、特異性及敏感性等方面均存在一定程度的局限性。建立行之有效、快速在線的食源性致病菌的定量檢測方法，提高檢測速度和效率，在保障公共衛(wèi)生及食品安全方面具有重要意義。
　　免疫磁珠是偶聯(lián)有特定抗體的磁性微球，通過免疫學反應(yīng)，在磁場作用下能從復(fù)雜基質(zhì)中特異性富集目標微生物。外

2、膜蛋白是革蘭氏陰性菌所特有的一種特殊蛋白質(zhì)，具有很好的免疫原性，被證實為很有潛力的疫苗抗原。本實驗擬探索利用重組致病菌外膜蛋白的特異性抗體制備免疫磁珠，結(jié)合熒光定量PCR檢測技術(shù)，建立食品樣品中沙門菌快速檢測的方法。
　　在生物信息學分析基礎(chǔ)之上，從致病性沙門菌、耶爾森菌和空腸彎曲菌分別擴增了pagC、ail和cfrA外膜蛋白基因。通過分子生物學手段原核表達并純化制備了三種重組外膜蛋白PagC、Ail和CfrA，為后續(xù)的抗血清及免

3、疫磁珠的制備打下了研究基礎(chǔ)。
　　利用純化的沙門菌PagC蛋白制備多克隆抗體，偶聯(lián)磁珠后形成免疫磁珠。對磁珠最優(yōu)抗體包被量、免疫磁珠捕獲沙門菌的能力及特異性指標進行了探究。結(jié)果顯示免疫磁珠的最佳抗體包被量為116μg/mg磁珠。當0.1mg免疫磁珠捕獲濃度為101-104 CFU/mL的沙門菌時，捕獲效率達70％以上；對非沙門菌的捕獲效率均在8%以下。
　　建立了熒光定量 PCR檢測沙門菌的方法，并對檢測的靈敏度、準確性、特

4、異性等相關(guān)指標進行考量。結(jié)果顯示該方法在沙門菌濃度為101-107 CFU/mL范圍內(nèi)相關(guān)性良好，最低檢出限為18 CFU/mL，重復(fù)性和特異性良好。利用免疫磁珠分離技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的手段，對模擬豬肉及全脂牛奶污染樣品中沙門菌的快速檢測表明，該方法能夠有效檢出沙門菌并進行定量，且檢測結(jié)果與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的結(jié)果相當。整套檢測方法耗時在10 h內(nèi)，與傳統(tǒng)國標沙門菌檢測方法相比，顯著縮短了檢測時間，是快速檢測食品中沙門菌的有效候