死亡相關(guān)蛋白(DAP5)對(duì)順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：順鉑(cisplatin,DDP)是當(dāng)前腫瘤聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。由于可造成急性腎小管損傷而限制了其臨床應(yīng)用,其中腎小管上皮細(xì)胞凋亡是順鉑引起急性腎小管細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。死亡相關(guān)蛋白(DeathAssociated Protein,DAP5)作為調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的重要因子,在應(yīng)激或凋亡等經(jīng)典蛋白質(zhì)翻譯途徑被抑制的情況下,DAP5可通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site,IRES)

2、途徑來(lái)促進(jìn)某些蛋白質(zhì)翻譯表達(dá),以維持細(xì)胞的正常生存。但是DAP5在順鉑引起急性腎小管損傷過(guò)程中具體機(jī)制還不清楚。本研究在體內(nèi)和體外建立順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡模型的基礎(chǔ)上,觀察DAP5在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)變化,研究DAP5對(duì)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響,探討DAP5在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)針。進(jìn)而研究DAP5是否受調(diào)控蛋白翻譯的重要信號(hào)通路(PBK/Akt/mToR)的影響,為臨床防護(hù)順鉑引起

3、的急性腎損傷提供新的方法。
　　 方法：⑴順鉑誘導(dǎo)急性腎小管上皮細(xì)胞凋亡體內(nèi)與體外模型的建立:對(duì)青年Wistar大鼠腹腔注射順鉑72h后,建立體內(nèi)腎小管細(xì)胞凋亡模型,利用腎功能指標(biāo)和腎組織病理評(píng)分對(duì)腎臟損傷程度進(jìn)行評(píng)估,TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,western blot方法檢測(cè)caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化情況；應(yīng)用不同濃度梯度的順鉑對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK(

4、C)刺激24h后建立體外模型,應(yīng)用細(xì)胞核Hocbtest染色及流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),western blot方法驗(yàn)證上述凋亡相關(guān)指標(biāo)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。⑵DAP5調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡的作用。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術(shù)過(guò)表達(dá)及下調(diào)HKC細(xì)胞內(nèi)的DAP5表達(dá),在此基礎(chǔ)上觀察對(duì)順鉑誘導(dǎo)這兩種HKC細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度,western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白水平的表達(dá),探討DAP5

5、在順鉑誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制。檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的變化,并應(yīng)用triciribine(Akt特異性抑制荊)和rapamycin(mToR特異性抑制劑)阻斷該信號(hào)通路后,用western blot檢測(cè)對(duì)DAP5表達(dá)變化的影響,探討PI3K/Akt/mTOR通路與DAP5的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果：大鼠經(jīng)腹腔注射順鉑72h后,發(fā)生急性腎損傷,血肌酐及尿素氮明顯增高。病理組

6、織學(xué)顯示近端腎小管上皮細(xì)胞損傷,出現(xiàn)空泡樣變性和顆粒樣變性,近端腎小管擴(kuò)張,腎小管腔中可見(jiàn)蛋白質(zhì)管型。小管刷狀緣脫落,細(xì)胞排列紊亂。腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色后陽(yáng)性率明顯增加。應(yīng)用western blot對(duì)caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表達(dá)水平在模型組中較對(duì)照組明顯增高,Bcl-2則較對(duì)照組

7、明顯下降。在體外應(yīng)用不同濃度的順鉑(1～100μM)作用于HKC細(xì)胞24h后,采用Hochest染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡隨順鉑濃度的增加而增加。對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的凋亡相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的變化一致,caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表達(dá)水平隨順鉑濃度的增高而增加,而B(niǎo)cl-2則隨之下降。同時(shí),在順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡過(guò)程中,可見(jiàn)DAP5裂解生成86KDa片段的蛋白質(zhì)-DAP5/p86。

8、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)DAP5/p97和DAP5/p86后均可使Bcl-2的表達(dá)增加,并可減輕順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而利用siRNA負(fù)向調(diào)控DAP5則可使Bcl-2表達(dá)下降,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。過(guò)表達(dá)或負(fù)向調(diào)控DAP5均對(duì)Bax的表達(dá)無(wú)影響。進(jìn)而在順鉑誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè),可見(jiàn)PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)下調(diào),提示該信號(hào)通路被抑制,應(yīng)用triciribine和rapamycin阻斷PI3K/

9、Akt/mTOR通路后可見(jiàn)DAP5表達(dá)下降,Bcl-2和Bax表達(dá)降低。因而發(fā)現(xiàn)DAP5受PI3K/Akt/mTOR通路的正向調(diào)控。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功建立了順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的體內(nèi)與體外模型,首次對(duì)DAP5在順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中DAP5可裂解為86KDa的蛋白片段DAP5/p86,全長(zhǎng)DAP5/p97與裂解后DAP5/p86均可促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的翻