電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白β減輕糖尿病腎病腎小管上皮細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，一旦出現(xiàn)大量蛋白尿，腎功能將不可逆性進行性下降，最終發(fā)展為終末期腎病。由于其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無理想的治療方案。過去研究的重點聚焦在高血糖對糖尿病及其并發(fā)癥的危害上，近些年人們認為脂肪酸代謝障礙是糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)病理生理改變。其中血游離脂肪酸升高在非脂肪組織蓄積造成的損傷，即脂毒性，既是糖尿病患者發(fā)病的可能病因之一，也是促進疾病進展和加重的關(guān)鍵因素。在糖尿病腎病中，脂毒

2、性已被證實是進展性腎小管損傷的重要病理機制之一，并和腎臟疾病預(yù)后密切相關(guān)。電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白（electron transfer flavoprotein，ETF）是脂肪酸β氧化中12種線粒體脫氫酶的電子接受體，由α和β亞單位組成，存在于生物體細胞線粒體內(nèi)。本實驗室前期通過糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ETFβ在保守序列位點出現(xiàn)點突變，提示其可能在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　目的:
　　本研究通過建立不同糖尿

3、病腎病大鼠模型以觀察ETFβ的表達和分布，及與糖尿病腎損傷之間的關(guān)系和機制;通過過表達和敲降技術(shù)，探討ETFβ在棕櫚酸(plamitate，PA)誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡中所起的作用。綜合體內(nèi)外實驗評價ETFβ在糖尿病腎病中的作用，為進一步深入認識糖尿病腎病發(fā)病機制提供新思路，同時為疾病治療提供新的藥物候選靶點。
　　方法;
　　體內(nèi)實驗分為兩部分，首先分別通過鏈脲佐菌素腹腔注射合并高脂飼料喂養(yǎng)制備輕度腎損傷模型，及鏈脲佐菌

4、素注射合并單側(cè)腎切除誘導(dǎo)重度糖尿病腎損傷大鼠模型，探討ETFβ在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的兩種糖尿病腎病模型大鼠腎皮質(zhì)中表達的變化。此外，通過2型自發(fā)性糖尿病OLETF大鼠模型，觀察腎病進展的兩個階段，分別為36周齡的輕度腎損傷和56周齡的重度腎損傷。用Western blot和免疫組化方法檢測ETFβ在正常及模型組大鼠腎皮質(zhì)的分布和表達情況;固定腎組織通過PAS染色觀察腎臟病理損傷，然后分析ETFβ的表達變化與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。此外

5、，在OLETF大鼠模型中，分析腎損傷的機制:用TUNEL法檢測兩個時間點的細胞凋亡情況，然后通過Western blot檢測線粒體凋亡通路蛋白變化，包括胞漿細胞色素C、BAX、Bcl-2及Cleaved caspase-3的表達變化，此外檢測腎組織NOX4的表達。
　　體外實驗部分，探討ETFβ對脂肪酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響及其機制。首先通過敲降實驗觀察了ETFβ在低表達時對脂肪酸誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響:設(shè)計并篩選出敲降效率

6、高的ETFβ基因siRNA Oligo干擾序列，轉(zhuǎn)染至大鼠近端腎小管上皮細胞NRK52E，24h后在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5 mM PA，再過24 h后檢測ROS生成，BAX、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達，通過流式檢測線粒體膜電位和細胞凋亡率，TUNEL法檢測細胞凋亡情況，比較脂肪酸誘導(dǎo)的細胞凋亡通路改變與敲降ETFβ合并脂肪酸刺激的差異，分析ETFβ低表達對脂毒性凋亡的影響。另一方面，通過構(gòu)建ETFβ過表達

7、重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細胞，觀察在ETFβ高表達時線粒體凋亡通路以及細胞凋亡率的變化，分析ETFβ過表達對脂肪酸誘導(dǎo)的NRK52E凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1 ETFβ表達與糖尿病腎病進展之間的相關(guān)性
　　(1) ETFβ在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的不同糖尿病腎病大鼠模型中的表達:鏈脲佐菌素注射合并高脂飼料喂養(yǎng)建立的糖尿病腎病模型中，蛋白尿最大量為41.6 mg/24h，腎小管輕度損傷;在鏈脲佐菌素注射合并單側(cè)腎切除誘導(dǎo)的糖尿病腎

8、病模型中，蛋白尿達300 mg/24h，腎小管上皮細胞出現(xiàn)玻璃滴樣變和空泡變性，部分腎小管擴張或萎縮，管腔內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)或蛋白管型，間質(zhì)可見散在的淋巴細胞和單核細胞浸潤及纖維化，比高脂飼料喂養(yǎng)合并STZ注射模型腎損傷程度更加嚴重。通過比較輕度、重度兩種糖尿病腎損傷模型發(fā)現(xiàn)ETFβ只在重度腎損傷模型中表達下降。
　　(2)在自發(fā)性2型糖尿病OLETF大鼠模型中，36周齡OLETF大鼠出現(xiàn)少量蛋白尿和輕度腎損傷，發(fā)展至56周齡時模型

9、組大鼠出現(xiàn)大量尿蛋白，腎臟病理損害進一步加重，出現(xiàn)廣泛的腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，ETFβ只在56周齡重度糖尿病腎損傷大鼠腎組織中表達下降。
　　2重度糖尿病腎損傷大鼠腎小管凋亡機制
　　TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)36周齡OLETF大鼠腎小管細胞很少凋亡，56周齡OLETF大鼠腎小管上皮細胞過度凋亡，同時Cleaved caspase-3的表達也只在56周齡OLETF大鼠腎皮質(zhì)升高，進一步檢測發(fā)現(xiàn)56周齡OLETF大鼠腎皮質(zhì)中胞漿細

10、胞色素C及BAX表達升高，Bcl-2表達下降;此外，腎組織NOX4的表達升高。
　　3 ETFβ減輕脂肪酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡及其機制ETFβ敲降對脂肪酸誘導(dǎo)的NRK52E細胞凋亡的影響:將設(shè)計的三對siRNA序列分別轉(zhuǎn)染至NRK52E細胞中，通過Western blot實驗篩選出敲除率達90％的一條siRNA序列，用于進一步研究。脂肪酸刺激腎小管上皮細胞的實驗結(jié)果顯示:0.5 mMPA刺激NRK52E細胞24h后，ROS生成

11、增加，線粒體膜電位下降，BAX的表達升高，而Bcl-2表達下降，Cleaved caspase-3升高，流式及TUNEL均檢測到細胞大量凋亡。ETFβ基因被敲除后，以上線粒體凋亡通路中指標的改變及細胞凋亡率均在PA刺激的基礎(chǔ)上進一步加重，初步推測ETFβ的低表達促進了PA誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路的激活。
　　此外，ETFβ過表達對脂肪酸誘導(dǎo)的NRK52E細胞凋亡的影響顯示:酶切和測序結(jié)果均顯示ETFβ過表達重組質(zhì)粒序列正確，將構(gòu)建好的

12、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NRK52E細胞后發(fā)現(xiàn)融合蛋白在細胞中能成功表達。與PA刺激NRK52E對照組相比，ETFβ高表達組線粒體膜電位有所回升，ROS的量和BAX表達均有所降低，Bcl-2的表達升高，Cleaved caspas-3表達下降，細胞凋亡率有所下降，過表達的結(jié)果證實了ETFβ基因有減輕脂肪酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用。
　　結(jié)論:
　　ETFβ的表達隨著糖尿病腎損傷進展在腎臟出現(xiàn)明顯下降，提示ETFβ參與糖尿病腎病進

13、展。糖尿病腎病后期腎小管上皮細胞過度凋亡，胞漿細胞色素C表達升高等分子學(xué)改變顯示線粒體凋亡通路激活參與糖尿病腎病腎小管凋亡。此外，脂肪酸刺激可引起NRK52E細胞ETFβ表達明顯下降，同時伴隨著細胞線粒體凋亡通路激活及細胞凋亡率的顯著升高;在此基礎(chǔ)上降低細胞ETFβ表達后可以進一步促進細胞凋亡;而過表達ETFβ可部分逆轉(zhuǎn)PA誘導(dǎo)的線粒體凋亡。由此我們推測ETFβ的下調(diào)可能參與了糖尿病腎病腎小管上皮細胞的凋亡過程，同時ETFβ高表達可能減