植物乳桿菌降膽固醇突變株的構(gòu)建與初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室從西藏傳統(tǒng)的乳制品Kefir粒當(dāng)中分離獲得一株具有高效降膽固醇能力的植物乳桿菌MA2，該菌株具有良好的發(fā)酵特性和益生功能，其膽固醇移除率最高可達(dá)45％，是一株在功能性食品領(lǐng)域有著廣闊應(yīng)用前景的菌株。
　　以植物孚乳桿菌MA2為研究對(duì)象，對(duì)其膽固醇移除率影響因素膽固醇添加濃度、菌體生長(zhǎng)狀態(tài)、菌體濃度與存活狀態(tài)以及膽鹽添加進(jìn)行了探究。采用Mμ轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入的誘變方法，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)化將Mμ轉(zhuǎn)座復(fù)合物誘導(dǎo)連入植物乳桿菌MA2基因組中，

2、對(duì)其降膽固醇功能表型改變進(jìn)行初步篩選研究。通過(guò)Mμ轉(zhuǎn)座子插入的方法，篩選降膽固醇能力顯著改變的突變株，若其插入位點(diǎn)是相關(guān)負(fù)調(diào)控基因，則其降膽固醇能力上升;若插入位點(diǎn)是直接調(diào)控降膽固醇的基因或者是相關(guān)正調(diào)控基因，則其降膽固醇能力下降。
　　通過(guò)構(gòu)建含Mμ轉(zhuǎn)座子的大腸桿菌重組質(zhì)粒pUC18，經(jīng)重組質(zhì)粒提取、酶切、切膠回收、濃縮，使其濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需濃度標(biāo)準(zhǔn)，成功制備Mμ轉(zhuǎn)座復(fù)合物。利用優(yōu)化好的電轉(zhuǎn)化條件，細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600nm≈0.

3、5時(shí)制備感受態(tài)，恢復(fù)培養(yǎng)基蔗糖添加終濃度為0.1 mol/L，恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間為2h，在2 kV，25μF，電阻200Ω條件下，對(duì)其進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，將Mμ轉(zhuǎn)座復(fù)合物導(dǎo)入植物乳桿菌MA2基因組。經(jīng)5μg/mL氯霉素抗性平板初步篩選獲取突變株，提取突變株基因組提取，利用轉(zhuǎn)座序列上氯霉素抗性基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證突變株中Mμ轉(zhuǎn)座子片段，構(gòu)建突變子庫(kù)，其結(jié)果顯示在660bp處有明亮特異性條帶，共獲得166個(gè)突變子。
　　利用改良的

4、鄰苯二甲醛法對(duì)166個(gè)突變株進(jìn)行膽固醇移除率測(cè)定，結(jié)果顯示，與野生菌MA2相比，99號(hào)和163號(hào)突變子膽固醇移除率顯著下降，分別為22.5％和32.3％，表明該突變子Mμ轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因?yàn)榻的懝檀脊δ苤苯踊蚧蛘咂湎嚓P(guān)正調(diào)控基因，相關(guān)基因被破壞，其降膽固醇能力相應(yīng)下降。獲得的其他突變子膽固醇移除率與野生菌MA2基本一致，表明其Mμ轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因與降膽固醇功能并不相關(guān)。以上研究結(jié)果為后續(xù)分離轉(zhuǎn)座子插入的側(cè)翼序列，從分子生物學(xué)角度研究