動(dòng)物源性食品中司帕沙星免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、司帕沙星(Sparfloxacin，SPFX)，是一種抗菌活性強(qiáng)、具有代表性的氟喹諾酮類抗生素藥物，廣泛應(yīng)用于治療呼吸道、尿路、腸、膽道、皮膚和軟組織感染;司帕沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖也大有用途，能促進(jìn)黃鱔等快速生長(zhǎng)。但是易在動(dòng)物臟器等組織中形成累積性殘留的司帕沙星，主要通過(guò)人們熟知的食物鏈進(jìn)入到人體，嚴(yán)重影響甚至危害到人類健康。本著控制氟喹諾酮類藥物的濫用，保障動(dòng)物性食品安全和關(guān)心大眾健康的宗旨，國(guó)內(nèi)和國(guó)外已經(jīng)開(kāi)發(fā)出有效的檢測(cè)方法，用于監(jiān)測(cè)其動(dòng)

2、態(tài)發(fā)展，但傳統(tǒng)的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)手段相對(duì)落后，因此，建立快速、便捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的檢測(cè)方法是滿足監(jiān)督、監(jiān)控司帕沙星濫用的迫切需要。
　　本論文對(duì)司帕沙星免疫學(xué)特性進(jìn)行分析和研究，運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備抗司帕沙星的單抗，開(kāi)發(fā)了司帕沙星快速檢測(cè)的工具即試劑盒，主要研究結(jié)果如下:
　　1.司帕沙星人工抗原的制備與鑒定
　　根據(jù)司帕沙星(SPFX)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，采用混合酸酐法和DCC法，將SPFX和載體牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)

3、，合成免疫原SPFX-BSA，用DCC法將SPFX和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，合成包被原SPFX-OVA。對(duì)人工合成抗原鑒定主要通過(guò)紫外掃描法(UV)、凝膠電泳法(SDS-PAGE)和免疫小鼠獲得多克隆血清的ELISA方法進(jìn)行鑒定。紫外掃描圖譜顯示，合成的人工抗原的最大紫外吸收峰發(fā)生明顯的位移;SDS-PAGE結(jié)果表明免疫原的泳動(dòng)速度慢于載體蛋白，說(shuō)明與載體蛋白相比，免疫原的分子量要相對(duì)較大;免疫小鼠后所獲得的血清對(duì)SPFX具有明顯的敏感

4、性，最終說(shuō)明SPFX與BSA偶聯(lián)成功，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明用混合酸酐法合成的免疫原免疫效果優(yōu)于DCC方法。
　　2.SPFX單克隆抗體的制備及免疫學(xué)特性鑒定
　　用SPFX-BSA對(duì)4只BALB/C小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)檢測(cè)，選出1只血清效價(jià)高、抑制價(jià)好的小鼠成為細(xì)胞融合小鼠，利用雜交瘤技術(shù)將能分泌SPFX抗體的免疫小鼠脾細(xì)胞與能大量繁殖生長(zhǎng)的NS0瘤細(xì)胞進(jìn)行相互融合，獲取能分泌SPFX單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞株。經(jīng)檢測(cè)、篩選、克

5、隆化等系列程序后，獲得一株特異敏感性都較好的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4H4C8。用體內(nèi)誘生腹水的方法生產(chǎn)得到SPFX mAb，經(jīng)過(guò)鑒定，4H4C8對(duì)SPFX的IC50為27.63ng/mL，與其他同系物或化合物沒(méi)有出現(xiàn)明顯的交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)制備的SPFX mAb能用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中SPFX的殘留。
　　3.司帕沙星免疫快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā)
　　依據(jù)ELISA原理，在本研究所制備的SPFX mAb的基礎(chǔ)上，優(yōu)化各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，研