桂枝加葛根湯對(duì)大鼠頸椎間盤(pán)維環(huán)細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 為了探討桂枝加葛根湯治療頸椎病的的作用機(jī)理研究,建立大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,采用不通濃度的桂枝加葛根湯大鼠含藥血清進(jìn)行分組干預(yù),從分子水平及超微結(jié)構(gòu)水平觀察桂枝加葛根湯通過(guò)影響纖維環(huán)細(xì)胞,探索其與纖維環(huán)退變關(guān)系,進(jìn)而深化桂枝加葛根湯治療頸椎病的的臨床治療作用,間接促進(jìn)中藥治療頸椎病的臨床推廣應(yīng)用。
　　 方法:
　　 (1)將80只清潔級(jí)成年SD大鼠按體質(zhì)量(200～230g)隨機(jī)分為4組

2、,即空白組(20只)采用2mL生理鹽水灌胃;中藥低劑量組(20只)采用1mL桂枝加葛根湯藥液灌胃;中藥中劑量組(20只)采用2mL桂枝加葛根湯藥液灌胃;中藥高劑量組(20只)采用4mL桂枝加葛根湯藥液灌胃。各組連續(xù)灌胃4天(2次/天),制備不同濃度的桂枝加葛根湯大鼠含藥血清。
　　 (2)通過(guò)酶消化法貼壁分離體外培養(yǎng)大鼠頸椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞,采用甲苯胺藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和透射電鏡觀察對(duì)其進(jìn)行表型鑒定。
　　 (3)采

3、用自制桂枝加葛根湯含藥血清對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù),連續(xù)干預(yù)6天。利用透射電鏡觀察桂枝加葛根湯干預(yù)后纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化;采用熒光定量PCR測(cè)定各組纖維環(huán)細(xì)胞Aggrecan-mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)纖維環(huán)細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定:培養(yǎng)的細(xì)胞具有甲苯胺藍(lán)異染性;Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原單克隆抗體檢測(cè)到培養(yǎng)的細(xì)胞有Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的陽(yáng)性表達(dá);光鏡觀察細(xì)胞多呈近圓形、梭形或多角形,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多粗面內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng);透射電鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)符合軟骨細(xì)胞特點(diǎn)。
　　 (2)透射電鏡下觀察不同濃度桂枝加葛根湯含藥血清干預(yù)后各組纖維環(huán)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化:中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較空白組及低劑量組明顯增多,出現(xiàn)電子密度較大的蛋白質(zhì)沉淀,以高劑量組最為明顯。
　　 (3)熒光定量PCR檢測(cè)桂枝加葛根湯含藥血清干預(yù)后纖維環(huán)細(xì)胞中蛋白多糖Aggrecan-mRNA的表達(dá)變化:中、高劑量組Aggrecan-mRNA表達(dá)的Ct值明顯高于空白組(P

5、＜0.05),低劑量組Ct值與空白組比較無(wú)明顯差異,而高劑量組Ct值明顯高于中劑量組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.采用酶消化法成功貼壁分離培養(yǎng)了纖維環(huán)細(xì)胞,完成對(duì)細(xì)胞的表型鑒定,符合纖維環(huán)細(xì)胞的特征,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了前提條件。
　　 2.桂枝加葛根湯含藥血清使纖維環(huán)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變:中、高劑量組使纖維環(huán)細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體數(shù)量增多,蛋白沉淀增多,這提示桂枝加葛根湯從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上增強(qiáng)蛋白分泌的能