hITF基因治療腸源性感染的體內(nèi)外實驗研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩96頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、背景:
   腸三葉因子(intestinAltrefoil factor,ITF)是由腸杯狀細胞特異分泌的小分子多肽,它的59個氨基酸序列中有一段特殊的核心結(jié)構(gòu)域,其間的6個半胱氨酸按特定(1-5,2-4和3-6)的順序,依次以二硫鍵兩兩相接,形成3個環(huán)狀結(jié)構(gòu),整個肽鏈由此發(fā)生彎曲和折疊,形如“三葉草”,故名腸三葉因子(ITF)。ITF 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便受到廣大學者的廣泛關注,大量的研究表明,ITF在腸黏膜的自我保護及修復機制中占據(jù)

2、重要地位。作為一個具有廣泛應用前景的藥物前體,卻因為復雜的制備過程、較低的產(chǎn)量限制了它的應用?;蛑委熓墙陙沓霈F(xiàn)的嶄新的治療手段,是將人正?;蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學高技術。若通過基因治療的途徑將ITF基因?qū)塍w內(nèi),可以使ITF在體內(nèi)大量表達,有望簡化繁瑣的操作程序、降低昂貴的生產(chǎn)成本。
   目的:
   篩選并構(gòu)建hITF 理想的

3、基因傳遞系統(tǒng);探索hITF基因治療對燒傷后腸源性感染的作用。
   方法:
   1.首先從人小腸內(nèi)膜提取總RNA,再利用RT-PCR 技術獲得hITF信號肽及成熟肽cDNA,然后克隆至質(zhì)粒pEGFP-N1獲得重組載體,最后雙酶切及測序鑒定。
   2.利用復凝法制備殼聚糖納米粒,用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)及大小,以Zeta電位儀檢測不同N/P 比及pH對Zeta 電位的影響,瓊脂糖電泳分析納米粒對基因的包裹和保

4、護能力,并計算納米粒的包封率和載藥量,最后分析其釋放曲線。
   3.利用殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞,熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)錄情況,Western Blot 檢測hITF表達情況。
   4.將穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)、目的基因(pEGFP-N1-hITF)雙酶切,以T4DNA連接酶連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF。重組質(zhì)粒PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)

5、粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組,PacⅠ酶切鑒定。重組腺病毒載體在HEK293細胞中包裝,根據(jù)Karbers 公式計算病毒顆粒滴度。
   5.將重組腺病毒感染人結(jié)腸癌細胞株(HT-29、Caco-2),然后行RT-PCR及WB檢測,從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平檢測hITF表達情況;感染病毒細胞做爬片后行細胞免疫熒光檢查;最后通過劃痕實驗,檢測重組腺病毒對結(jié)腸癌細胞遷移功能的影響。
   6..首先制備30%T

6、BSA Ⅲ°燒傷小鼠模型,并給予重組腺病毒灌胃,在相應時相點取標本檢測腸黏膜損傷指數(shù)、絨毛高度、隱窩深度、病理切片、冰凍切片、腸道菌群移位率以及血清LPS,以觀察Ad-hITF對小鼠燒傷后腸源性感染是否具有治療組用。
   結(jié)果:
   1.獲得hITF信號肽+成熟肽全長基因序列,并成功插入真核表達載體pEGFP-N1構(gòu)建出重組載體,雙酶切鑒定后送基因測序,結(jié)果證明目的基因與Genbank 數(shù)據(jù)庫所收錄的基因序列完全一致

7、,遂命名為pEGFP-N1-hITF。
   2.利用復凝法制備了不同N/P 比的殼聚糖納米粒,透射電鏡觀察到粒度集中在300-500nm,粒徑呈窄分布;Zeta 電位與N/P 比呈正相關,而與pH值呈負相關;凝膠阻滯實驗說明殼聚糖在N/P 比大于1時可以完全包裹質(zhì)粒;DNA 保護實驗說明納米??梢员Wo內(nèi)部質(zhì)粒免受DNAse I的降解;包封率隨著N/P 比的增加而增加,載藥量則隨著N/P 比的增加而減??;體外釋放試驗顯示,納米粒

8、釋放速度先快后滿,而且隨著N/P 比的增加而逐漸減慢。
   3.熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測顯示,殼聚糖納米粒對HEK293細胞的轉(zhuǎn)染率約為80%,和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率基本一致;RT-PCR和WB 檢測說明,hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達。
   4.成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組,PacⅠ酶切鑒定后命名為Ad-hITF;重組腺病毒載體在HEK2

9、93細胞中包裝,獲得重組腺病毒顆粒;根據(jù)Karbers 公式計算病毒顆粒滴度為2×109pfu/ml。
   5.重組腺病毒在MOI=50的滴度下可以感染人結(jié)腸癌細胞株(HT-29、Caco-2),感染效率接近100%;RT-PCR和WB 檢測說明,hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達;細胞免疫熒光顯示,hITF 可表達于細胞核和細胞漿,但以細胞漿為主;劃痕實驗證明感染重組腺病毒對結(jié)腸癌細胞具有很強的促遷移能力。
   6.成

10、功制備了30%TBSA Ⅲ°燒傷小鼠模型,給予重組腺病毒灌胃后,燒傷小鼠腸黏膜損傷指數(shù)明顯低于B組,絨毛高度、隱窩深度顯著高于B組;病理切片提示Ad-hITF組損傷情況明顯較輕,冰凍切片顯示hITF 已表達于腸黏膜;腸道菌群移位率以及血清LPS 檢測提示,Ad-hITF組顯著低于B組。
   結(jié)論:
   1.基因測序證明重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-hITF構(gòu)建成功。
   2.復凝法制備出殼聚糖納米粒,其

11、直徑小于500nm,Zeta 電位陽性,能有效保護內(nèi)部基因。
   3.殼聚糖納米粒能高效轉(zhuǎn)染HEK293細胞,并分泌表達出成熟hITF。
   4.成功構(gòu)建出含hITF基因的重組腺病毒載體Ad-hITF。
   5.Ad-hITF能高效感染結(jié)腸癌細胞,并分泌表達出成熟hITF,且對細胞遷移具有顯著的促進作用。
   6.Ad-hITF 可顯明顯減輕燒傷小鼠腸黏膜損傷、促進修復,對燒傷后腸源性感染具有良好

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論