hITF基因治療腸源性感染的體內(nèi)外實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
   腸三葉因子(intestinAltrefoil factor,ITF)是由腸杯狀細(xì)胞特異分泌的小分子多肽,它的59個氨基酸序列中有一段特殊的核心結(jié)構(gòu)域,其間的6個半胱氨酸按特定(1-5,2-4和3-6)的順序,依次以二硫鍵兩兩相接,形成3個環(huán)狀結(jié)構(gòu),整個肽鏈由此發(fā)生彎曲和折疊,形如“三葉草”,故名腸三葉因子(ITF)。ITF 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便受到廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注,大量的研究表明,ITF在腸黏膜的自我保護(hù)及修復(fù)機(jī)制中占據(jù)

2、重要地位。作為一個具有廣泛應(yīng)用前景的藥物前體,卻因為復(fù)雜的制備過程、較低的產(chǎn)量限制了它的應(yīng)用?;蛑委熓墙陙沓霈F(xiàn)的嶄新的治療手段,是將人正?;蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。若通過基因治療的途徑將ITF基因?qū)塍w內(nèi),可以使ITF在體內(nèi)大量表達(dá),有望簡化繁瑣的操作程序、降低昂貴的生產(chǎn)成本。
   目的:
   篩選并構(gòu)建hITF 理想的

3、基因傳遞系統(tǒng);探索hITF基因治療對燒傷后腸源性感染的作用。
   方法:
   1.首先從人小腸內(nèi)膜提取總RNA,再利用RT-PCR 技術(shù)獲得hITF信號肽及成熟肽cDNA,然后克隆至質(zhì)粒pEGFP-N1獲得重組載體,最后雙酶切及測序鑒定。
   2.利用復(fù)凝法制備殼聚糖納米粒,用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)及大小,以Zeta電位儀檢測不同N/P 比及pH對Zeta 電位的影響,瓊脂糖電泳分析納米粒對基因的包裹和保

4、護(hù)能力,并計算納米粒的包封率和載藥量,最后分析其釋放曲線。
   3.利用殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)錄情況,Western Blot 檢測hITF表達(dá)情況。
   4.將穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)、目的基因(pEGFP-N1-hITF)雙酶切,以T4DNA連接酶連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF。重組質(zhì)粒PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)

5、粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組,PacⅠ酶切鑒定。重組腺病毒載體在HEK293細(xì)胞中包裝,根據(jù)Karbers 公式計算病毒顆粒滴度。
   5.將重組腺病毒感染人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29、Caco-2),然后行RT-PCR及WB檢測,從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平檢測hITF表達(dá)情況;感染病毒細(xì)胞做爬片后行細(xì)胞免疫熒光檢查;最后通過劃痕實驗,檢測重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移功能的影響。
   6..首先制備30%T

6、BSA Ⅲ°燒傷小鼠模型,并給予重組腺病毒灌胃,在相應(yīng)時相點取標(biāo)本檢測腸黏膜損傷指數(shù)、絨毛高度、隱窩深度、病理切片、冰凍切片、腸道菌群移位率以及血清LPS,以觀察Ad-hITF對小鼠燒傷后腸源性感染是否具有治療組用。
   結(jié)果:
   1.獲得hITF信號肽+成熟肽全長基因序列,并成功插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1構(gòu)建出重組載體,雙酶切鑒定后送基因測序,結(jié)果證明目的基因與Genbank 數(shù)據(jù)庫所收錄的基因序列完全一致

7、,遂命名為pEGFP-N1-hITF。
   2.利用復(fù)凝法制備了不同N/P 比的殼聚糖納米粒,透射電鏡觀察到粒度集中在300-500nm,粒徑呈窄分布;Zeta 電位與N/P 比呈正相關(guān),而與pH值呈負(fù)相關(guān);凝膠阻滯實驗說明殼聚糖在N/P 比大于1時可以完全包裹質(zhì)粒;DNA 保護(hù)實驗說明納米??梢员Wo(hù)內(nèi)部質(zhì)粒免受DNAse I的降解;包封率隨著N/P 比的增加而增加,載藥量則隨著N/P 比的增加而減??;體外釋放試驗顯示,納米粒

8、釋放速度先快后滿,而且隨著N/P 比的增加而逐漸減慢。
   3.熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測顯示,殼聚糖納米粒對HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率約為80%,和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率基本一致;RT-PCR和WB 檢測說明,hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達(dá)。
   4.成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組,PacⅠ酶切鑒定后命名為Ad-hITF;重組腺病毒載體在HEK2

9、93細(xì)胞中包裝,獲得重組腺病毒顆粒;根據(jù)Karbers 公式計算病毒顆粒滴度為2×109pfu/ml。
   5.重組腺病毒在MOI=50的滴度下可以感染人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29、Caco-2),感染效率接近100%;RT-PCR和WB 檢測說明,hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達(dá);細(xì)胞免疫熒光顯示,hITF 可表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿,但以細(xì)胞漿為主;劃痕實驗證明感染重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的促遷移能力。
   6.成

10、功制備了30%TBSA Ⅲ°燒傷小鼠模型,給予重組腺病毒灌胃后,燒傷小鼠腸黏膜損傷指數(shù)明顯低于B組,絨毛高度、隱窩深度顯著高于B組;病理切片提示Ad-hITF組損傷情況明顯較輕,冰凍切片顯示hITF 已表達(dá)于腸黏膜;腸道菌群移位率以及血清LPS 檢測提示,Ad-hITF組顯著低于B組。
   結(jié)論:
   1.基因測序證明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-hITF構(gòu)建成功。
   2.復(fù)凝法制備出殼聚糖納米粒,其

11、直徑小于500nm,Zeta 電位陽性,能有效保護(hù)內(nèi)部基因。
   3.殼聚糖納米粒能高效轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并分泌表達(dá)出成熟hITF。
   4.成功構(gòu)建出含hITF基因的重組腺病毒載體Ad-hITF。
   5.Ad-hITF能高效感染結(jié)腸癌細(xì)胞,并分泌表達(dá)出成熟hITF,且對細(xì)胞遷移具有顯著的促進(jìn)作用。
   6.Ad-hITF 可顯明顯減輕燒傷小鼠腸黏膜損傷、促進(jìn)修復(fù),對燒傷后腸源性感染具有良好

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