裂解型腺病毒基因治療人肝癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建裂解型腺病毒載體，研究其體內(nèi)外治療人肝癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移瘤的效果和機(jī)理。 方法：抽提QBI-293A細(xì)胞的基因組DNA，根據(jù)Genebank公布的第5血清型腺病毒(Ad5)的E1A基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，采用PCR技術(shù)克隆人E1A基因，將其亞克隆到pUCm-T載體并鑒定。以測(cè)序正確的pUCm-T-E1A為模板，酶切目的基因片段，連接到轉(zhuǎn)移載體pAdTrack-CMV上，形成重組載體pAdTrack-CMV-E1

2、A。重組載體經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy一1腺病毒載體在BJ5I83大腸桿菌中同源重組，得到的重組腺病毒載體pAdeasy．1-pAdTrack-CMV-ElA經(jīng)PacI酶切后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，獲得重組裂解型腺病毒rAd-E1A。rAd-E1A感染人肝癌細(xì)胞HepG2，SMMC一7721和人正常肝細(xì)胞HL-7702，顯微鏡下觀察rAd-E1A對(duì)細(xì)胞的裂解效果，MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAd-E1A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋

3、亡作用。RT-PCR和Western-blotting鑒定rAd-E1A的作用機(jī)理。在nu／nu裸鼠皮下建立SMMC一7721人肝癌的動(dòng)物模型，觀察rAd-E1A基因治療肝癌的效果，并進(jìn)一步研究其機(jī)理。在小白鼠腹水型肝癌H22基因治療模型中，檢測(cè)rAd-E1A對(duì)小白鼠免疫器官(胸腺，脾臟)和免疫細(xì)胞(白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞)的影響。MTT法檢測(cè)rAd-E1A對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304生長(zhǎng)的影響，ELISA檢測(cè)對(duì)ECV

4、304細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的影響，Western-blotting鑒定rAd-E1A對(duì)ECV304細(xì)胞的NF-r．_B。 結(jié)果：成功獲得1194bp的E1A基因及其上游開(kāi)放可譯框架(ORF)，序列測(cè)定結(jié)果與GenBank報(bào)道的完全一致。并成功構(gòu)建了裂解型腺病毒rAd-E1A，可顯著裂解人肝癌細(xì)胞HepG2，SMMC-772l，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702作用較弱。rAd-ElA可體內(nèi)抑

5、制人肝癌和小鼠腹水型肝癌的生長(zhǎng)，且對(duì)小白鼠的免疫器官?zèng)]有抑制，同時(shí)可提高中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)目。rAd-E1A在人肝癌細(xì)胞中上調(diào)Fas，Bax，下調(diào)survivin和Bcl-2的表達(dá)，另外在人肝癌組織中上調(diào)凋亡相關(guān)因子p53，p27，Caspase-3，下調(diào)血管生成相關(guān)因子VEGF和CD34的表達(dá)。rAd-ElA明顯抑制ECV304內(nèi)皮細(xì)胞增殖和下調(diào)vEGF和NF-κB的表達(dá)。 結(jié)論：裂解型腺病毒rAd-E1A可在體外裂解人