基于農桿菌介導的圓紅冬孢酵母遺傳重組系統(tǒng)的研究.pdf

1、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)可在胞內積累油脂、類胡蘿卜素等，具有工業(yè)化應用潛力。為改善其生產性狀及研究相關分子機制，需要建立有效的遺傳操作系統(tǒng)。目前已獲得了R.toruloides的多組學信息，并建立了基于農桿菌介導轉化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)的方法。然而，在R.toruloides中非同源末端連接(Non-ho

2、mologous end joining，NHEJ)機制占主導，難以利用成熟的同源重組(Homologous recombination，HR)技術進行靶基因敲除，而基于ATMT技術只能隨機整合外源基因，并且仍存在流程長、篩選標記有限等突出問題。針對上述問題，在R.toruloides中建立基于重組機制的遺傳操作方法:探索通過農桿菌介導同源重組來進行靶基因敲除;建立位點特異性重組系統(tǒng)來進行多基因整合。主要研究內容及成果如下:
　　

3、1)ATMT介導同源重組敲除靶基因。選擇八氫番茄紅素脫氫酶基因CRTI作為靶基因，設計并構建帶有CRTI同源臂的潮霉素(HYG)表達盒敲除載體pZPK-CRT-H，以R.toruloides的單倍體NP11為出發(fā)菌株，采用ATMT技術進行染色體整合，構建CRTI基因敲除菌NP11-ΔCRT.結果顯示，約2％的轉化子呈白色表型，不能合成類胡蘿卜素，并且在其基因組DNA樣品中未檢測到完整的CRTI基因。分別構建強啟動子PGPD和PADH2控

4、制CRTI表達的載體pZPK-CRT-1和pZPK-CRT-2對NP11-ΔCRT進行基因回補，轉化后產生了具有類胡蘿卜素合成能力的紅色轉化子，回補菌株胞內類胡蘿卜素含量為309μg/g，與出發(fā)菌株NP11相比提高了30％.上述研究表明，在R.toruloides中基于同源重組的基因打靶效率極低，明確了CRTI的功能，并為改造R.toruloides提供了一個新的篩選標記基因。
　　2)構建基于Cre/loxP技術的位點特異性重組

5、系統(tǒng)。構建三種類型的HYG和博來霉素(BLE)雙抗性雙表達盒載體進行載體功能驗證，其中正向連接的雙表達盒載體pZPK-H-BLE-2通過ATMT技術驗證了載體的功能;用重組酶基因替換pZPK-H-BLE-2上的BLE，構建重組酶表達載體(pZPK-H-GPD-CRE，pZPK-H-GPD-CREP)及帶有BLE表達盒的重組位點載體(pZPK-Loxp-B).其中重組酶基因Crep從pSH65上擴增而來，而Cre為根據(jù)R.toruloid

6、es密碼子偏好性重新設計并合成的重組酶基因。將重組位點和重組酶載體依次轉化至NP11中，發(fā)現(xiàn)表達Cre的轉化子不能在含有博來霉素的平板上生長，該表型符合loxP重組位點間BLE抗性基因被刪除的預期結果。上述結果表明，在R.toruloides中，成功建立了基于Cre/loxP技術的基因重組操作方法。
　　3)構建并完善基于FLP/FRT技術的位點特異性重組系統(tǒng)。分別構建重組酶載體pZPK-H-GPD-FLP及重組位點載體pZPK-

7、FRT-B，依次轉化至NP11中，未能獲得FRT重組位點間抗性基因被刪除的表型。分析挖掘R.toruloides核定位序列信息，提出融合表達重組酶FLP和轉錄因子RHTO_01582的核定位信號序列NLS3的思路，構建內源核定位信號融合重組酶表達載體pZPK-GPD-FLP-NLS3，再通過農桿菌介導轉化至整合了重組位點表達盒的R.toruloides工程菌NP11-FRT-B中，成功獲得了表型符合FRT重組位點間抗性基因刪除的轉化子，

8、從而初步建立了基于FLP/FRT的重組方法。為精確控制FLP的表達，分別構建了抗生素自敲除載體pZPK-FRT-NAT-ADH2-FLP-NLS3及誘導型表達的FLP工程菌NP11-H-ADH2-FLP-NLS3，使FLP在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中被誘導表達，能夠通過重組來刪除抗性基因。在R.toruloides中建立并完善了基于FLP/FRT技術的基因重組系統(tǒng)，為更復雜的基因操作奠定了基礎。
　　4)FLP/FRT重組酶系統(tǒng)的應用。

9、構建帶有重組位點的功能基因雙表達盒載體pZPK-FRT-NAT/BLE-gene，轉化至工程菌NP11-H-ADH2-FLP-NLS3中，通過FLP的誘導表達，刪除了抗生素標記基因，建立了標記基因循環(huán)使用的方法。將甲醇利用途徑4個關鍵基因(MDH,HPS,PHI,PTA)，依次整合到R.toruloides染色體上，獲得了染色體整合表達五個外源基因的R.toruloides工程菌。將來源于三孢布拉霉Blakeslea trispora)

10、的類胡蘿卜素合成相關基因(CarB，CarRP)整合至CRTI基因缺失菌株NP11-ΔCRT中，工程菌株重新獲得了類胡蘿卜素合成能力。為考察FLP/FRT技術在其它紅酵母中應用的可行性，基于ATMT將FLP/FRT系統(tǒng)表達元件分別整合至海洋紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa，CGMCC2.1515)和紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides，CGMCC2.1609)中，獲得了染色體整合外源基因