SIGIRR對氣道上皮TOLL樣受體致炎信號通路的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 TOLL樣受體(TLRs)廣泛分布于人的氣道上皮細(xì)胞中,它們介導(dǎo)了病原微生物所致呼吸道感染時的氣道炎癥反應(yīng)。單免疫球蛋白樣白介素1受體相關(guān)蛋白(SIGIRR)是TIRs超家族成員,它可以負(fù)性調(diào)節(jié)TLR/IL-1受體介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答。本實驗是以人氣道上皮細(xì)胞株H292作為研究對象,明確SIGIRR在人氣道上皮細(xì)胞中發(fā)揮的作用及可能的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.SIGIRR的亞細(xì)胞定位

2、研究
　　 (1)構(gòu)建一個增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體(SIGIRR-EGFP),并經(jīng)測序證實。
　　 (2)運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,將重組質(zhì)粒(SIGIRR-EGFP)瞬時轉(zhuǎn)染H292細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下,進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究,并以空質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的H292細(xì)胞(EH292)、未轉(zhuǎn)染的H292細(xì)胞(H292)對照。
　　 (3)采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位對照

3、,進(jìn)一步證明SIGIRR在H292細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況。
　　 2.致炎因子的ELISA檢測
　　 (1)通過800gg/ml的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,單克隆化操作后,利用熒光定量RT-PCR挑選出SIGIRR表達(dá)相對較強(qiáng)的細(xì)胞株(RH292-2),作為進(jìn)一步實驗的對象(RH292)。
　　 (2)對獲得的RH292、EH292、H292細(xì)胞計數(shù)后,以1×106接種于12孔板的每個孔中,當(dāng)生長到70～80％的

4、時候,進(jìn)行減血清培養(yǎng)24hrs,再分別用Flagellin(1,0.2,和0.05μg/ml),LPS(1,0.2,和0.05μg/ml)and CpG DNA2006(1,0.2,和0.05μM)處理細(xì)胞6hrs后,ELISA檢測各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6及TNF-α的濃度。
　　 3.Western blot檢測SIGIRR和TLR4、5、9表達(dá)
　　 (1)對RH292、EH292、H292細(xì)胞計數(shù)后,以1x106

5、接種于6孔板中,待生長至90％左右時,分別收集細(xì)胞,并檢測各組細(xì)胞中TLR4、5、9表達(dá)情況;
　　 (2)用LPS(1μg/m1),Flagellin(0.1μg/m1)and CpG DNA2006(0.5μM)分別處理上述三組細(xì)胞24hrs,在刺激的1、6、24 hrs時,分別收集并檢測三組細(xì)胞中SIGIRR和TLR4、5、9的表達(dá)情況。
　　 4.免疫共沉淀檢測SIGIRR與MyD88的相互作用。
　　

6、(1)用LPS(1μg/m1)、Flagellin(0.1μg/m1)、CpG DNA2006(0.5μM)處理6孔板中生長至90％左右的RH292、EH292、H292細(xì)胞6hrs后,分別收集細(xì)胞裂解液。
　　 (2)用1μg SIGIRR多抗和20μ1蛋白A-瓊脂糖珠,4℃共孵育過夜,再用裂解緩沖液洗滌瓊脂糖珠4次后,行SDS-PAGE分離。
　　 (3)Western blotting分析SIGIRR和MyD88蛋

7、白表達(dá)情況,并以β-actin的表達(dá)代表每個樣品種細(xì)胞裂解液上樣量。
　　 結(jié)果:
　　 1.激光共聚焦觀察顯示融合蛋白SIGIRR-EGFP主要表達(dá)在H292細(xì)胞的細(xì)胞膜上,在細(xì)胞核周有少量表達(dá),但不進(jìn)入細(xì)胞核,而空質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的EGFP則在整個細(xì)胞中彌散分布;免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示重組融合蛋白SIGIRR-EGFP與H292細(xì)胞中內(nèi)源SIGIRR共定位于細(xì)胞膜上,說明SIGIRR在H292細(xì)胞中定位于細(xì)胞膜

8、上。
　　 2.成功篩選出了兩個SIGIRR過表達(dá)的細(xì)胞株RH292-1和RH292-2,實時熒光定量RT-PCR顯示這兩個細(xì)胞株中SIGIRRmRNA是未轉(zhuǎn)染H292細(xì)胞的14和44倍。故選擇RH292-2作為進(jìn)一步實驗對象(RH292);在三種不同濃度的特異性配體LPS、Flagellin、CpG DNA2006處理之后,SIGULR過表達(dá)的H292細(xì)胞(RH292)產(chǎn)生的致炎因子IL-6濃度分別為39.52±0.62、39

9、.12±0.51、33.32±2.38pg/ml,58.61±1.13、28.354±1.05、14.24±0.93 pg/ml,5.12±0.22、3.27±0.13、2.37±0.46 pg/ml,TNF-α濃度分別為78.45±2.11、69.56±2.47、64.32±1.72 pg/ml,58.29±1.91、48.53±0.78、24.49±0.66 pg/ml,10.25±0.67、8.29±0.35、4.54±0.60

10、pg/ml,均顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(EH292)組或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(H292)組(P＜0.01),而后兩者IL-6和TNF-α的表達(dá)水平則沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),說明SIGIRR降低了H292細(xì)胞TLR4、5、9介導(dǎo)的致炎因子表達(dá)。
　　 3.實時熒光定量RT-PCR和Western blotting顯示H292細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后,即RH292細(xì)胞、EH292、H292中TLR4、5、9的mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.0

11、5);進(jìn)一步在一定濃度的LPS、Flagellin、CpG DNA2006處理1、6、24hrs后,各組細(xì)胞中TLR4、5、9的蛋白表達(dá)也沒有顯著性差異(P＞0.05),說明過表達(dá)SIGIRR不能調(diào)節(jié)H292細(xì)胞中FLR4、5、9的表達(dá);此外,在受到外界病原分子刺激時,SIGIRR和TLR4、5、9表達(dá)早期迅速減少,然后逐漸增加至24時,呈時間依賴性模式,這種相似的表達(dá)模式也反應(yīng)了炎癥應(yīng)答時的免疫平衡;
　　 4.通過SIGIR

12、R與MyD88免疫共沉淀實驗,可見H292細(xì)胞經(jīng)過LPS,Flagellin和CpG DNA2006處理1 h后,SIGIRR與MyD88分子發(fā)生明顯的相互作用。在同一濃度配體刺激下,RH292細(xì)胞中與SIGIRR結(jié)合的MyD88分子顯著(P＜0.05)多于EH292和H292,而與SIGIRR結(jié)合的MyD88分子在EH292和H292中則沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示人氣道上皮細(xì)胞受到TLRs的配體刺激后,SIGIRR與MyD8

13、8有較強(qiáng)相互作用,即SIGIRR可能與TLR4、5、9競爭結(jié)合MyD88接頭分子。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)載體SIGIRR-EGFP,證實了SIGIRR在人氣道上皮細(xì)胞中亞定位于細(xì)胞膜上,是一個膜受體蛋白。
　　 2.SIGIRR可以顯著降低人氣道上皮細(xì)胞TLR4、5、9介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。
　　 3.SIGIRR抑制人氣道上皮細(xì)胞,致炎因子產(chǎn)生的作用不是降低了TLR4、5、9的表