中國(guó)地方山羊PRNP、SPRN和37-67-kDa LRP-LR基因研究.pdf

1、羊癢病是一種傳染性海綿狀腦病(TSEs),是由正常的宿主細(xì)胞型朊蛋白構(gòu)象改變且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累引起的。本研究從中國(guó)地方山羊品種入手,對(duì)與TSEs發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的三個(gè)基因PRNP、SPRN和37/67-kDa LRP/LR進(jìn)行研究,為從遺傳學(xué)角度控制山羊癢病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ),并為中國(guó)地方山羊的抗癢病育種提供依據(jù)。
　　 利用生物信息學(xué)對(duì)PRNP基因的系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行研究,對(duì)屬于26個(gè)科56個(gè)屬的83個(gè)物種共計(jì)937條PRNP基因

2、編碼區(qū)序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明所有物種PRNP基因編碼區(qū)長(zhǎng)度變異為567-825bp,主要是由于種內(nèi)或種間重復(fù)區(qū)的插入/缺失引起的。PRNP基因優(yōu)先利用終止密碼子TGA。在反芻動(dòng)物中,牛具有最小的核苷酸差異(0.811)和多樣性(0.0011)和較小的非同義核苷酸多樣性。海豚科具有最小的總突變(3)、沉默突變(2)、非同義突變(1)、平均核苷酸差異數(shù)(2.000)、同義核苷酸多樣性(π(s),0.00739)和非同義核苷酸多樣性(π(a)

3、,0.00113)。鼠科具有最大的總突變(349)、沉默突變(94)、非同義突變(253)、平均核苷酸差異數(shù)(150)和核苷酸多樣性(0.19617)。鼠科和?？凭哂休^高的非同義核苷酸多樣性與同義核苷酸多樣性比值π(a)/π(s)(0.673和1.209)?；诓煌苹蛭锓NPRNP基因,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹除了貓科以外,基本與NCBI上的分類學(xué)一致。
　　 對(duì)山羊PRNP基因編碼區(qū)突變位點(diǎn)在中國(guó)地方山羊中的分布進(jìn)行研究,對(duì)8個(gè)省份1

4、1個(gè)中國(guó)地方山羊品種共計(jì)337份血液/腎臟樣品,提取山羊基因組DNA,PCR擴(kuò)增山羊PRNP基因,通過序列測(cè)定,對(duì)PRNP基因多態(tài)性進(jìn)行分析,以確定PRNP基因的多態(tài)性情況以及這些山羊品種對(duì)癢病的感染風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)山羊PRNP基因編碼區(qū)存在10個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(102、127、143、146、154、211、218、219、222和240)和3個(gè)同義替代位點(diǎn)(42、125和138),其中R211G和T219I為首次發(fā)現(xiàn)。這些氨基酸變異位

5、點(diǎn)共組成28個(gè)等位基因和49個(gè)基因型,與山羊癢病抗性有關(guān)的142M在所研究的山羊群體中未檢測(cè)到,其他與抗性/潛伏期相關(guān)的位點(diǎn)146S、154H和127S分別只在1個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到,對(duì)感染癢病具有保護(hù)作用的211Q在22個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到,重要的癢病抗性候選位點(diǎn)222K在所研究的地方山羊中分布較低。等位基因在中國(guó)南北方地區(qū)地方山羊品種中的分布存在著差異。研究結(jié)果將為評(píng)估中國(guó)地方山羊患病風(fēng)險(xiǎn)提供重要資料。
　　 對(duì)山羊PRNP基因非編碼區(qū)

6、的序列特征和變異位點(diǎn)進(jìn)行分析,PCR擴(kuò)增5’UTR、內(nèi)含子1和3’UTR,利用獲得的序列進(jìn)行分析,山羊PRNP基因含有2個(gè)CpG島。推測(cè)啟動(dòng)子核心區(qū)域?yàn)?648-5169bp,該區(qū)域包括15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測(cè)4個(gè)保守基序motif1、motif2、motif3和motif4序列分別為轉(zhuǎn)錄因子YY1、E4BP4、Foxp3和COE1的結(jié)合位點(diǎn)。內(nèi)含子1具有啟動(dòng)子活性。在山羊PRNP基因5’側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)52個(gè)SNPs,3’UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)3

7、5個(gè)SNPs。對(duì)引起轉(zhuǎn)錄因子C/EBP a1pha結(jié)合位點(diǎn)的丟失的2140位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析,結(jié)果表明等位基因A(GA非缺失)為優(yōu)勢(shì)等位基因,等位基因B(GA缺失)在不同群體中的基因頻率在0.1452-0.4000之間。遼寧絨山羊和太行山羊中B基因頻率較低,并且沒有發(fā)現(xiàn)BB基因型。利用熒光素酶報(bào)告基因載體研究2140位點(diǎn)變異對(duì)啟動(dòng)子活性的影響,表明該位點(diǎn)變異改變了啟動(dòng)子活性。
　　 利用Westem blot對(duì)PrPc在山羊組織

8、器官中的表達(dá)進(jìn)行研究,PrPc在太行山羊小腦、腦干、丘腦、肝臟、脾臟、腎臟和肌肉中均表達(dá),尤其在小腦、腦干、丘腦中表達(dá)量最高。在肺臟中未檢測(cè)到表達(dá)。雙糖基化PrP在所研究的組織中為主要表現(xiàn)形式。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)PrPc在山羊組織器官中的分布進(jìn)行研究,在小腦分子層、顆粒層和浦肯野細(xì)胞、丘腦與腦干的神經(jīng)元細(xì)胞體、腎臟腎小球和近曲小管、肝臟細(xì)胞和脾臟髓系樹突狀細(xì)胞檢測(cè)到PrPc的表達(dá)。
　　 克隆獲得了山羊SPRN基因包括完整開

9、放閱讀框在內(nèi)的4237bp,開放閱讀框?yàn)?41bp,編碼146個(gè)氨基酸。該基因不含TATA盒或CCAAT盒,存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1、AP-2和YY1的結(jié)合位點(diǎn)。利用熒光素酶報(bào)告基因載體對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行研究,表明在323-1329bp存在調(diào)控基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn),而在111-323bp間存在著抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控的調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)。在山羊SPRN基因發(fā)現(xiàn)36個(gè)突變位點(diǎn),其中啟動(dòng)子區(qū)10個(gè),內(nèi)含子1中3個(gè),編碼區(qū)7個(gè)(5個(gè)引起氨基酸變異)

10、,15個(gè)位于3’UTR。組織表達(dá)譜結(jié)果表明該基因在山羊大腦和小腦中表達(dá)量較高,在睪丸、腸系膜淋巴結(jié)和肺臟中有表達(dá)但很低,其他組織中未檢測(cè)到表達(dá)。
　　 克隆獲得了山羊37/67-kDa LRP/LR基因的基因組序列和完整編碼區(qū)cCNA序列,獲得了全長(zhǎng)為13587bp的基因組序列,由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成,開放閱讀框?yàn)?88bp,編碼295個(gè)氨基酸。山羊37/67-kDa LRP/LR基因在241、272和291處與其他易感癢

11、病的氨基酸序列相同。山羊37/67-kDa LRP/LR基因5’側(cè)翼區(qū)存在潛在的轉(zhuǎn)錄因子Sp1、AP-1和AP-2結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)存在著TATA盒和CCAAT盒。在山羊37/67-kDaLRP/LR基因發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn),其中外顯子1第17位的C→T突變影響Has-mir-1266,外顯子7中第84位A→G突變影響has-mir-518c-star。RT-PCR結(jié)果顯示37/67-kDaLRP/LR Mrna在山羊11個(gè)組織中均表達(dá),在大