人67kDa層粘連蛋白受體(67LR)在粘附介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480多藥耐藥中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、腫瘤多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。國(guó)內(nèi)外已在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了多種MDR相關(guān)分子并推測(cè)相應(yīng)的分子機(jī)制，但是并不能完全解釋腫瘤的MDR現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附可以導(dǎo)致耐藥，并將這種形式的耐藥稱為細(xì)胞粘附介導(dǎo)的耐藥（celladhesionmediateddrugresistance，CAM-DR）。研究發(fā)現(xiàn)，人67kDa層粘連蛋白受體（human67kDalam

2、ininreceptor，67LR）介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白（laminin，LN）的粘附與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究旨在研究67LR介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分LN粘附對(duì)于其藥物敏感性的影響，并深入探討67LR作為粘附分子參與結(jié)腸癌CAM-DR的分子機(jī)制，將有助于全面理解結(jié)腸癌MDR的發(fā)生和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　目的：研究粘附狀態(tài)下結(jié)腸癌細(xì)胞SW480對(duì)于多種化療藥物的耐受性，并初步探討其耐藥機(jī)制；以67

3、LR表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞亞系為模型，在67LR與其特異性配體LN相互識(shí)別介導(dǎo)SW480細(xì)胞粘附的狀態(tài)下，深入探討67LR的功能及其介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞CAM-DR的分子機(jī)制，將有助于全面理解結(jié)腸癌MDR的發(fā)生和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：1.通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)研究結(jié)腸癌細(xì)胞SW480與細(xì)胞外基質(zhì)重要組分LN及陰性對(duì)照成分牛血清白蛋白（BSA）粘附能力的差別；2.通過(guò)MTT比色法檢測(cè)粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480

4、對(duì)于化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）和順鉑（DDP）的藥物敏感性；3.借助流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)粘附于LN以及BSA的SW480細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并計(jì)算相應(yīng)的藥物泵出率；4.通過(guò)AnnexinV/PI染色法檢測(cè)粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480在化療藥物誘導(dǎo)下的凋亡，并計(jì)算相應(yīng)凋亡指數(shù)。
　　第二部分：構(gòu)建67LR的siRNA載體并轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，篩選并建立67LR表達(dá)下調(diào)的SW480轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞系。
　

5、　第三部分：1.通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞與LN以及BSA的粘附能力的差別；2.通過(guò)MTT比色法檢測(cè)粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞對(duì)于化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）和順鉑（DDP）的藥物敏感性；3.通過(guò)AnnexinV/PI染色法檢測(cè)粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞在化療藥物誘導(dǎo)下的凋亡

6、，并計(jì)算相應(yīng)凋亡指數(shù)；4.通過(guò)WesternBlot檢測(cè)粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞中凋亡信號(hào)途徑相關(guān)蛋白FAK的總蛋白及磷酸化蛋白、Bcl-2和Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：1.在單位時(shí)間內(nèi)，LN組中結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的粘附細(xì)胞數(shù)均明顯高于BSA組（p<0.05）；2.與粘附于BSA的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480相比，粘附于LN的SW480細(xì)胞的化療藥物敏感性顯著下

7、降，對(duì)于化療藥物的IC50均相應(yīng)顯著升高，化療藥物誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)明顯減少；細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯減少，藥物泵出率顯著增加（p<0.05）。
　　第二部分：成功篩選并建立67LR表達(dá)下調(diào)的SW480轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞系。
　　第三部分：1.在單位時(shí)間內(nèi)，LN組和BSA組內(nèi)67LR表達(dá)水平下調(diào)的
　　結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW480-si67LR的粘附細(xì)胞數(shù)均明顯低于其對(duì)照細(xì)胞（p<0.05）；2.與LN粘附后，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞S

8、W480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞中均檢測(cè)到磷酸化FAK的不同程度的表達(dá)，其中SW480-si67LR中磷酸化FAK的表達(dá)水平表達(dá)明顯下調(diào)，其相對(duì)表達(dá)率具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；3.與對(duì)照成分BSA粘附后，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞中均檢測(cè)不到磷酸化FAK的不同程度的表達(dá)；4.與LN及其對(duì)照成分BSA粘附后，SW480-si67LR及其對(duì)照細(xì)胞中總FAK的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；5.在與L

9、N粘附條件下，與其對(duì)照細(xì)胞相比67LR表達(dá)水平下調(diào)的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW480-si67LR的化療藥物敏感性顯著上升，對(duì)于化療藥物的IC50相應(yīng)顯著下降，化療藥物誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)明顯增加；細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)（p<0.05）。
　　結(jié)論：1.與細(xì)胞外基質(zhì)成分LN粘附后，結(jié)腸癌細(xì)胞可能通過(guò)以下兩種途徑增強(qiáng)自身的多藥耐藥性：i.提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，導(dǎo)致化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積的減少；ii.提高抗凋亡