解淀粉芽孢桿菌PEBA20與細菌群體行為相關基因研究.pdf

1、本研究主要檢測了解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)PEBA20的群體淬滅基因aiiA，并對其群體淬滅功能進行了分析；分析了生物膜形成相關的yqxMsipW-tasA 操縱子及sinR基因，并構建sinR 突變株，驗證了其對生物膜形成的功能。
　　 主要研究結果如下：
　　 1.從B.Amyloliquefaciens PEBA20基因組中克隆得到了aiiA基因，測序表明，該aiiA基因

2、含有753個堿基的開放閱讀框，同Genbank中提交的其它芽孢桿菌種aiiA 類似基因具有很高的同源性。該基因為首次從B.Amyloliquefaciens中獲得。
　　 2.構建了aiiA基因融合表達載體pEASY-E1/aiiA 并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌（Escherichiacoli BL21 DE3）中過量表達。SDS-PAGE 電泳表明，融合蛋白得到正確表達。其大小為28kDa。將aiiA基因表達產(chǎn)物進行功能分析發(fā)現(xiàn)，該Aii

3、A 融合蛋白對胡蘿卜軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum subsp.）侵染胡蘿卜具有很好的抑制作用。
　　 3.克隆了B.Amyloliquefaciens PEBA20中yqxM-sipW-tasA 操縱子，測序結果表明，yqxM 操縱子共有2078個堿基，tasA基因包含有786個堿基的開放閱讀框，yqxM基因包含有672個堿基的開放閱讀框。tasA基因的存在范圍比較廣，且相似度在65％-98％之

4、間。sipW基因和yqxM基因在BLAST 結果中只在B.Amyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)中有所發(fā)現(xiàn)。
　　 4.構建了pEASY-T1 空載體并以pEASY-T1 質(zhì)粒為模板擴增卡那霉素抗性基因（knar），將kna基因構建到pMD18-T中并轉(zhuǎn)入到E.Coli DH5α，最終，獲得了含有pMD18-T-kna的重組菌并能夠成功表達kna

5、抗性基因。
　　 5.根據(jù)B.Amyloliquefaciens FZB42基因組序列設計引物，以B.AmyloliquefaciensPEBA20染色體DNA 為模板，利用PCR 技術擴增sinR基因上游約650bp和基因下游600bp的兩端DNA序列作為打靶載體的同源長、短臂，將此兩段序列按同一方向分別插入骨架質(zhì)粒pMD18-T-kna中knar表達單元的5'端和3'端，構成重組質(zhì)粒pMD18-Tkna-sinR 作為基因打

6、靶載體。
　　 6.將構建好的sinR基因打靶載體用HindⅢ單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至B.Amyloliquefaciens PEBA20 感受態(tài)中，50 μg mL-1 卡那霉素抗性平板篩選。利用PCR 鑒定方法篩選PEBA20基因缺失株，檢測16個抗性轉(zhuǎn)化子確定基因突變株。其中，6號轉(zhuǎn)化子檢測到目的條帶，結果表明，sinR基因打靶載體成功進行重組。生物膜表型檢測表明，sinR基因突變株在固體和液體培養(yǎng)基中較野生株均形成了結構