腺苷鈷胺素合成酶基因cobs的克隆及在產(chǎn)1,3-丙二醇菌中的應(yīng)用.pdf

1、1,3-丙二醇作為一種化工原料，被廣泛應(yīng)用在聚合物、食品添加劑和醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。目前，由于1，3-丙二醇是合成新型聚合物(PTT)的單體而得到了重視。如今的興趣主要是集中在利用微生物發(fā)酵法合成1,3-丙二醇，其中以克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）為代表。1,3-丙二醇的生物合成途徑主要包括兩步反應(yīng)，其中甘油脫水酶是此反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，它需要在輔酶B12存在的情況下進行有效的催化。因此，在生物法轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇的過程

2、中需要添加VB12，然而VB12價格昂貴，影響工業(yè)化的成本。有關(guān)利用基因工程改造以減少添加VB12的研究在國內(nèi)尚未見報道。
　　 雖然有關(guān)1,3-丙二醇代謝途徑方面的研究已經(jīng)很多，但是關(guān)于輔酶B12在1，3-丙二醇代謝中的研究卻未見報道。本研究利用PCR擴增技術(shù)，從大腸桿菌(Escherichia coli)k-12菌株中擴增出產(chǎn)VB12關(guān)鍵酶-腺苷鈷胺素合成酶基因cobs，并且利用本實驗室所構(gòu)建質(zhì)粒pEtac上的tac啟動子成

3、功的構(gòu)建了含目的基因cobs的表達載體pEtac-cobs，并將其與包含甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶同功酶基因的重組質(zhì)粒pEtac-dhaB-tac-yqhD串聯(lián)，得到重組載體pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-yqhD，并將其轉(zhuǎn)化至克雷伯氏菌中。經(jīng)測定，重組Klebsiella pneumoniae(pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-yqhD)與原始K.pneumoniae(pEtac-dhaB-ta

4、c-yqhD)的甘油脫水酶的酶活分別為0.93U/mg、0.85U/mg，重組菌甘油脫水酶的酶活較原始菌提高了9.4％。初步發(fā)酵結(jié)果顯示，重組K.pneumoniae(pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-yqhD)在1,3-丙二醇產(chǎn)量無明顯變化的情況下所需額外添加的VB12由原始菌株的0.015g/L下降到0.006g/L。
　　 同時，對重組K.pneumoniae(pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-

5、yqhD)發(fā)酵培養(yǎng)基進行了單因素考察試驗，分別考察了不同氮源以及不同濃度的酵母膏、甘油、MgSO4·7H2O、葡萄糖和ATP對重組K.pneumoniae(pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-yqhD)發(fā)酵結(jié)果的影響，初步確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量為(g/L)：酵母膏7、甘油60、MgSO4·7H2O2.5、葡萄糖10、ATP0.06。還考察了不同的接種量及攪拌速度對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，最佳接種量為8％，最佳的攪拌

6、速度為先150r/min培養(yǎng)15h，后100r/min培養(yǎng)30h。
　　 在單因素考察試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗考察了甘油、MgSO4·7H2O、葡萄糖和VB12四個因素對重組K.pneumoniae(pEtac-cobs-tac-dhaB-tac-yqhD)發(fā)酵結(jié)果的影響。確定了最佳組合為(g/L)：甘油60、MgSO4·7H2O3.0、葡萄糖10、VB120.006，此時1,3-丙二醇的產(chǎn)量達到了32g/L，與原始K.pne

7、umoniae(pEtac-dhaB-tac-yqhD)在額外添加VB12量為0.015g/L時1,3-丙二醇的產(chǎn)量相當(dāng)。表明本研究所構(gòu)建的重組K.pneumoniae(pEtac-cobstac-dhaB-tac-yqhD)產(chǎn)出了更多的VB12，一方面為甘油脫水酶的有效催化提供了輔酶B12,另一方面為已失活的甘油脫水酶的復(fù)活起到了積極的促進作用，從而有效的提高了1,3-丙二醇的最終產(chǎn)量。因此本研究構(gòu)建的工程菌K.pneumoniae(