上海HIV-1分離株vif基因變異分析及vif蛋白功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過(guò)本研究對(duì)上海HIV-1分離株vif基因及蛋白的結(jié)構(gòu)深入了解;體外重組HIV-1Vif蛋白、制備Vif的鼠多克隆抗體并構(gòu)建Vif慢病毒載體感染細(xì)胞模型為進(jìn)一步研究利用RNAi技術(shù)干擾Vif表達(dá),論證以Vif入手進(jìn)行HIV-1干預(yù)的基因治療可行性。研究方法:利用RT-PCR法體外擴(kuò)增上海HIV-1分離株vif基因,通過(guò)測(cè)序并與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)HIV-1分離株比較分析上海HIV-1分離株vif基因的突變率,并導(dǎo)出氨基酸變異情況;進(jìn)一步構(gòu)建v

2、if基因pET32b(+)原核表達(dá)載體,利用BL21 star(DE3)(pLysS)細(xì)胞系表達(dá)并純化Vif蛋白,以純化的Vif蛋白免疫小鼠制備其鼠多克隆抗體,以ELISA法檢測(cè)重組的Vif蛋白及其多克隆抗體的功能;構(gòu)建HIV-1Vif慢病毒表達(dá)載體,感染HEK293T細(xì)胞及正常人PBMC細(xì)胞,并以Real-Time PCR法和SDS-PAGE檢測(cè)vif基因和Vif蛋白的表達(dá)。結(jié)果:本研究數(shù)據(jù)證實(shí)上海HIV-1分離株vif基因與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)

3、HIV毒株比較存在較高突變率,但在150bp～245bp(579bp)之間存在有相對(duì)保守的堿基序列,Vif蛋白的氨基酸存在一定的變異規(guī)律,這些氨基酸變異位點(diǎn)是否影響Vif的功能還不十分清楚,有待于進(jìn)一步研究;本研究重組、表達(dá)的HIV-1Vif蛋白,并成功制備了其多克隆抗體,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AIDS患者血清標(biāo)本中不存在或僅存在少量的HIV-1 Vif抗體,在HIV-1感染者體內(nèi)的檢測(cè)價(jià)值還可以進(jìn)一步研究:本研究成功構(gòu)建了表達(dá)Vif蛋白的慢病