肺上皮細胞表達的Sectm1b對膿毒癥ARDS的影響及作用機制.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指嚴重感染導致的全身炎癥反應綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，宿主針對感染的特異性免疫反應失調(diào)，進而可導致膿毒性休克、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），乃至引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是ICU患者的

2、主要死亡原因，其發(fā)病率仍然很高。膿毒癥急性呼吸窘迫綜合征的病理生理學機制非常復雜，包括炎癥激活、炎細胞浸潤、凝血系統(tǒng)激活和肺上皮屏障損傷等，其中肺上皮是急性呼吸窘迫綜合征時肺部防御損傷的一種重要結(jié)構(gòu)。在ARDS的致病過程中，各種炎癥因子、粘附分子、趨化因子和細胞因子等不斷釋放參與肺部炎癥反應，如腫瘤壞死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干擾素。肺上皮細胞能夠分泌多種細胞因子調(diào)控肺的天然免疫，目前卻沒有關于肺上皮細胞表達能夠調(diào)控肺部

3、天然免疫的分泌蛋白。因此，對于肺上皮細胞在膿毒癥急性呼吸窘迫綜合征的基因表達及相關分泌蛋白的機制探討值得研究，肺上皮細胞表達的分泌蛋白有望成為臨床上治療膿毒癥的新的分子靶點。
　　sectm1b基因是一種新型人類編碼基因，其基因表達的蛋白為sectm1b，即跨膜與分泌蛋白1b，屬于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表達調(diào)控機制以及效應并不清楚，關于sectm1b的研究也非常少。有研究認為：sectm1b可以抑制TCR介導的T

4、細胞活化從而發(fā)揮促炎的功能。炎癥反應的失衡是膿毒癥所致急性呼吸窘迫綜合征的主要原因。右美托咪定作為ICU臨床常用的鎮(zhèn)靜藥物，最近幾年，因為發(fā)現(xiàn)其具有抗炎的作用而逐漸被大家所關注，但目前沒有關于右美托咪定對膿毒癥ARDS時sectm1b表達的影響及抗炎作用的研究。另外，肺上皮細胞分泌的sectm1b能夠促進中性粒細胞表達和釋放促炎癥因子，對中性粒細胞募集到肺部感染部位具有調(diào)控作用。但是，sectm1b對膿毒癥ARDS時肺上皮細胞功能的作用

5、及其可能的機制，目前尚未見報道。
　　本研究擬通過在體與離體實驗，探討肺上皮細胞表達的sectm1b對膿毒癥ARDS的影響及作用機制。首先，對膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞高表達sectm1b的篩選及驗證;其次，探討肺上皮細胞表達的sectm1b對膿毒癥ARDS促炎作用及機制;最后，探討右美托咪定對膿毒癥ARDS小鼠抗炎作用及其機制的研究，同時探討了右美托咪定在膿毒癥ARDS發(fā)揮抗炎保護作用時對肺上皮細胞sectm1b表達的影響。<

6、br>　　第一部分 膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞高表達sectm1b的篩選及驗證
　　目的：
　　膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞高表達sectm1b的基因芯片篩選與分析，在體實驗和離體實驗驗證膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞高表達sectm1b。
　　方法：
　　1.取雄性C57小鼠，構(gòu)建CLP所致膿毒癥ARDS小鼠模型，分離CLP術后0h、6h、12h、24h的左肺組織，利用基因表達譜芯片檢測CLP術后不同時間及正常

7、對照小鼠肺上皮細胞基因表達差異。利用基因表達熱圖分析、genecard軟件分析及查閱文獻重點分析細胞因子與趨化因子等分泌性蛋白的表達。
　　2.取約8周齡雄性C57小鼠，隨機分為四組，分別為：CLP術后0h、CLP術后6h、CLP術后12h、CLP術后24h。
　　a.取每組小鼠肺組織，左肺組織行HE染色，并進行病理學評分;右肺組織提取mRNA，采取RT-PCR技術檢測sectm1b mRNA的表達情況。
　　b.取每

8、組小鼠支氣管肺泡灌洗液，采用ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式細胞術進行中性粒細胞計數(shù)。
　　c.于每組小鼠行眼球取血，離心后取血清，采用ELISA法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的表達情況。
　　3.用LPS刺激小鼠肺上皮細胞MLE12，于LPS誘導后0h、6h、12h、24h提取mRNA，利用RT-PCR檢測肺上皮細胞sectm1b mRNA的表達，同時收集上清，采用ELISA檢測上

9、清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
　　結(jié)果：
　　1.膿毒癥ARDS小鼠肺組織中基因表達差異顯著，其中sectm1b在CLP術后12h表達顯著增高，24h表達下降。
　　2.
　　a.HE染色結(jié)果顯示：CLP術后小鼠肺組織病理損傷明顯加重，且術后12h損傷程度強于24h，病理學評分增高(P＜0.05)。sectm1b mRNA表達差異顯著（12小時大于正常約30倍）(P＜0.05)。
　　b.EL

10、ISA結(jié)果顯示：與正常對照比較，肺泡灌洗液和血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)。CLP術后中性粒細胞計數(shù)明顯增多（P＜0.05）。
　　3.與正常相比，膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞sectm1b表達增高(P＜0.05)，上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細胞高表達sectm1b，膿毒癥ARDS小鼠在體

11、實驗模型與離體實驗模型建立成功，為后續(xù)的在體和離體實驗提供了可靠的實驗基礎。
　　第二部分 肺上皮細胞表達的sectm1b對膿毒癥ARDS促炎作用及機制探討
　　目的：
　　研究sectm1b對LPS誘導的肺上皮細胞在膿毒癥ARDS炎癥反應中的作用及其機制探討。
　　方法：
　　采用siRNA轉(zhuǎn)染技術沉默sectm1b基因的表達，研究在LPS誘導的肺上皮細胞MLE12在沉默sectm1b時對膿毒癥ARDS炎

12、癥反應的作用及其機制。實驗分為:NCsiRNA組和sectm1b siRNA組，轉(zhuǎn)染48小時后，分別用LPS刺激，提取LPS刺激后不同時間點的細胞總mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技術檢測sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表達，用ELISA技術檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平，利用western-blot方法檢測炎癥相關信號通路(NF-κβ/MAPK)相關分子的表達。
　　結(jié)果：
　　1

13、.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導12h后，RT-PCR顯示sectm1b siRNA組sectm1b的mRNA表達水平明顯低于NC-siRNA組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導6h、12h、24h后，sectm1b siRNA組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平較NC siRNA組降低(P＜0.05)，同時ELISA結(jié)果顯示sectm1b

14、 siRNA組上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平較NCsiRNA組降低（P＜0.05）。
　　3.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導12h后，與NC siRNA組相比，sectm1bsiRNA組的p65/p38/erk磷酸化表達水平下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　肺上皮細胞表達的sectm1b對膿毒癥ARDS具有促炎作用，其促炎作用可能與NF-κβ/MAPK信號通路的激活有關，表明sec

15、tm1b在膿毒癥肺上皮細胞的損傷具有重要作用。
　　第三部分 右美托咪定對膿毒癥小鼠肺上皮細胞sectm1b表達的影響及保護作用研究
　　目的：
　　探討右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)在膿毒癥小鼠肺上皮細胞炎癥反應中的作用及其對sectm1b表達的影響。
　　方法：
　　將C57小鼠隨機分為3組:CLP組、CLP+Dex組、Sham組。給藥組在小鼠CLP術前15min腹腔注射右美托咪定

16、（50ug/Kg），CLP組小鼠在術前15min腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。收集每組CLP術后0h，6h，12h，24h的血清和肺泡灌洗液(BALF)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，記錄24h內(nèi)小鼠的存活率。體外培養(yǎng)傳代小鼠肺上皮細胞MLE12，分為空白對照組（未進行任何處理）、脂多糖組(LPS，1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定組(LPS，1ug/ml+Dex，0.2ug/ml），R

17、T-PCR檢測總細胞中sectm1b mRNA的表達，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，蛋白質(zhì)印跡實驗檢測ERK1/2和JNK磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.與CLP組相比，右美托咪定組膿毒癥小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達下降，小鼠24h內(nèi)的存活率上升(P＜0.05)。
　　2.與脂多糖組相比，右美托咪定組上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達減少，

18、并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P＜0.05)。
　　3.與脂多糖組相比，右美托咪定組肺上皮細胞sectm1b mRNA的表達下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　右美托咪定能夠影響膿毒癥小鼠肺上皮細胞sectm1b的表達，同時能夠減少膿毒癥小鼠血清和肺泡灌洗液中炎癥因子的產(chǎn)生，提高膿毒癥小鼠24h內(nèi)的存活率，對小鼠肺上皮細胞炎癥反應發(fā)揮保護作用，且右美托咪定的這種作用可能與抑制ERK1/2和JNK的激活有