基于環(huán)糊精的黃曲霉毒素B1熒光增敏檢測技術(shù)研究.pdf

1、黃曲霉毒素B1(AFB1)目前發(fā)現(xiàn)的已知毒性最強(qiáng)的天然化學(xué)致癌物質(zhì)之一,廣泛存在于花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品及食品中,嚴(yán)重威脅著人畜健康和生命安全,對(duì)AFB1檢測是當(dāng)前農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和食品安全的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。針對(duì)目前AFB1前處理過程中基質(zhì)干擾嚴(yán)重,檢測靈敏度低等問題,本文采用了免疫親和柱結(jié)合熒光增強(qiáng)檢測的方法,建立了高靈敏度的AFB1檢測技術(shù),對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食品安全,打破農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易技術(shù)壁壘等均具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。主要研究結(jié)

2、果如下:
　　 1.通過對(duì)β-環(huán)糊精及其衍生物2,6-二甲基-β-環(huán)糊精對(duì)黃曲霉毒素B1熒光增強(qiáng)作用的研究,確定了反應(yīng)的激發(fā)波長為365nm,發(fā)射波長為440nm,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在2 mL10.0μg／kg黃曲霉毒素B1溶液中加入1 mL0.01 mol／Lβ-環(huán)糊精或其衍生物時(shí)AFB1熒光增強(qiáng)倍數(shù)最大,其中β-環(huán)糊精可使熒光信號(hào)增強(qiáng)5倍,2,6-二甲基-β-環(huán)糊精熒光增強(qiáng)倍數(shù)為8倍,表明2,6-二甲基-β-環(huán)糊精對(duì)黃曲霉毒素B

3、1熒光增強(qiáng)作用顯著；實(shí)驗(yàn)探索了環(huán)糊精和黃曲霉毒素B1之間的主客體包合作用,其主客體包合比為1:1,包合常數(shù)為12.237;黃曲霉毒素B1熒光增強(qiáng)前后的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.99以上；在室溫下利用該熒光增強(qiáng)劑,干擾金屬離子Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Cl-、(H2PO4)-(濃度低于10-2 mol／L)等以及花生基質(zhì)對(duì)環(huán)糊精的熒光增強(qiáng)作用沒有影響。
　　 2.利用高靈敏度AFB1單克隆抗體和氨基硅膠微球進(jìn)行偶

4、聯(lián),制備AFB1免疫親和柱,研究了免疫親和柱(IAC)的制備和特征特性。近紅外光譜結(jié)果顯示兩者的偶聯(lián)效果良好,氨基硅膠微球和粗提AFB1單克降抗體蛋白偶聯(lián),0.2 mL偶聯(lián)物的裝柱容量范圍為30 ng到107 ng AFB1可調(diào),平均蛋白偶聯(lián)率為87％;選擇樣液20％甲醇濃度為上樣濃度、磷酸鹽緩沖液作淋洗液、甲醇作洗脫劑為最佳的富集凈化條件；與商品化的黃曲霉毒素免疫親和柱和多功能凈化柱進(jìn)行實(shí)際花生樣品高效液相色譜法比對(duì)分析,三者的檢測結(jié)

5、果無顯著差異。兩種免疫親和柱特征特性比較顯示自制免疫親和柱AFB1的最低截獲量低至0.01μg／kg,并且柱容量高達(dá)107 ng,凈化時(shí)間縮短為10 min,成本低,操作簡單且具有良好的穩(wěn)定性,適合應(yīng)用于大批量樣品快速篩查。
　　 3.建立了基于新型熒光增強(qiáng)劑的AFB1免疫親和熒光光度快速檢測技術(shù),并優(yōu)化了花生中黃曲霉毒素B1的提取凈化條件。結(jié)果表明,樣品磨碎粒徑過20目篩,提取液80％甲醇水溶液,采用超聲波輔助提取的方法使提取

6、回收率為90％,建立了一套快速、準(zhǔn)確、簡易的IAC前處理技術(shù)；將β-環(huán)糊精熒光增強(qiáng)效應(yīng)引入黃曲霉毒素(AFT)免疫親和快速測定技術(shù)中,應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及食品中AFT檢測,提高了檢測的靈敏度,最低檢測限為0.3μg／kg,回收率為90％-115％；與基于國家標(biāo)準(zhǔn)方法的高效液相色譜法、ELISA法以及膠體金試紙條法進(jìn)行花生、飼料、玉米、花生油樣品的比對(duì)檢測,幾種檢測方法檢測結(jié)果一致,本項(xiàng)研究方法具有操作簡單,速度快,準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),同時(shí)提高了對(duì)