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文檔簡(jiǎn)介
1、甜葉菊(Steviarebaudiana(Bertoni)Hemsl)為國(guó)內(nèi)外著名的優(yōu)質(zhì)糖科植物,富含多種微量元素及營(yíng)養(yǎng)成分,既是極好的糖源,又是良好的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。萊鮑迪苷A(RebaudiosideA,RA)為甜葉菊的主要成分之一,屬四環(huán)二萜類衍生物,具有高甜度、低熱量的特性,對(duì)齲齒、高血壓、糖尿病、肥胖癥有一定治療作用,同時(shí)也是一種新型的甜味劑,具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
基于本實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果,本實(shí)驗(yàn)工作主要包括對(duì)RA單
2、克隆抗體的優(yōu)化制備,并以獲得的RA單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附分析法和免疫印跡分析法兩種檢測(cè)方法,以期對(duì)各種甜葉菊樣品中RA的含量進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。
主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
(1)采用高碘酸鈉法合成包被人工抗原RA-OVA和免疫人工抗原RA-HSA,經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定,載體蛋白連接的半抗原數(shù)分別為5和14個(gè)。
(2)用免疫人工抗原RA-HSA免疫4只Balb/C小鼠,加強(qiáng)免疫4次后,對(duì)4
3、只小鼠的脾細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞融合。
(3)使用PEG-1450介導(dǎo)小鼠免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),進(jìn)行第一次有限稀釋時(shí)取陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行RA和ST的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè),挑選交叉反應(yīng)率低的陽(yáng)性孔繼續(xù)有限稀釋,最終獲得2株穩(wěn)定分泌單克隆抗體且與ST交叉反應(yīng)率較低的雜交瘤細(xì)胞。
(4)選擇特異性較高的雜交瘤細(xì)胞株1AE12B7B1H5E1制備小鼠腹水,經(jīng)過(guò)ProteinG親和層析柱
4、分離純化得到單克隆抗體。凍干后得抗RA單克隆抗體29.1mg,平均產(chǎn)量為4.15mg/mL,單抗的分子量約為140kDa。
(5)1AE12B7B1H5E1單克隆抗體性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果為RA的IC50為1.287μg/mL,與ST的交叉反應(yīng)率為12.7%,與其余結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01%,親和常數(shù)分別為1.486×10-6mol/L,最低檢測(cè)限0.158μg/mL。
(6)利用制備的單克隆抗體建立競(jìng)爭(zhēng)E
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