萊鮑迪苷A單克隆抗體的制備優(yōu)化及其應(yīng)用.pdf

1、甜葉菊(Steviarebaudiana(Bertoni)Hemsl)為國內(nèi)外著名的優(yōu)質(zhì)糖科植物，富含多種微量元素及營養(yǎng)成分，既是極好的糖源，又是良好的營養(yǎng)來源。萊鮑迪苷A(RebaudiosideA，RA)為甜葉菊的主要成分之一，屬四環(huán)二萜類衍生物，具有高甜度、低熱量的特性，對齲齒、高血壓、糖尿病、肥胖癥有一定治療作用，同時也是一種新型的甜味劑，具有良好的開發(fā)前景。
　　 基于本實驗室的前期研究成果，本實驗工作主要包括對RA單

2、克隆抗體的優(yōu)化制備，并以獲得的RA單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附分析法和免疫印跡分析法兩種檢測方法，以期對各種甜葉菊樣品中RA的含量進(jìn)行檢測和評價。
　　 主要的實驗結(jié)果如下:
　　 (1)采用高碘酸鈉法合成包被人工抗原RA-OVA和免疫人工抗原RA-HSA，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定，載體蛋白連接的半抗原數(shù)分別為5和14個。
　　 (2)用免疫人工抗原RA-HSA免疫4只Balb/C小鼠，加強免疫4次后，對4

3、只小鼠的脾細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞融合。
　　 (3)使用PEG-1450介導(dǎo)小鼠免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行第一次有限稀釋時取陽性孔培養(yǎng)液進(jìn)行RA和ST的競爭ELISA檢測，挑選交叉反應(yīng)率低的陽性孔繼續(xù)有限稀釋，最終獲得2株穩(wěn)定分泌單克隆抗體且與ST交叉反應(yīng)率較低的雜交瘤細(xì)胞。
　　 (4)選擇特異性較高的雜交瘤細(xì)胞株1AE12B7B1H5E1制備小鼠腹水，經(jīng)過ProteinG親和層析柱

4、分離純化得到單克隆抗體。凍干后得抗RA單克隆抗體29.1mg，平均產(chǎn)量為4.15mg/mL，單抗的分子量約為140kDa。
　　 (5)1AE12B7B1H5E1單克隆抗體性質(zhì)檢測結(jié)果為RA的IC50為1.287μg/mL，與ST的交叉反應(yīng)率為12.7％，與其余結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01％，親和常數(shù)分別為1.486×10-6mol/L，最低檢測限0.158μg/mL。
　　 (6)利用制備的單克隆抗體建立競爭E