發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒遺傳進(jìn)化研究以及檢測(cè)方法檢測(cè)方法的建立.pdf

1、2007年5月，發(fā)熱伴血小板減少綜合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）首先在我國河南省信陽市報(bào)道。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該病病例高度散發(fā)，主要分布植被豐富的丘陵地帶或者山區(qū)，發(fā)病患者主要為中老年農(nóng)民，發(fā)病前有蜱叮咬史，符合蟲媒傳染病流行傳播的特點(diǎn)。最開始，人無形體(Anaplasma phagocytophilum)曾被認(rèn)為是此次SFTS的病原體。然而在之后的3年收集的

2、206例SFTS疑似病例中，最后確診為無形體感染陽性樣本僅有6例（約3％）在，并且均未分離出病原體。這說明該病可能是有新的病原體引起的。
　　2010年，中國疾病預(yù)防控中心和河南疾病預(yù)防控制中心的研究者先后確定了引起該病的病原體是一種新布尼亞病毒，并分別命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome Virus，SFTSV），和發(fā)熱，血小板和白細(xì)胞減少

3、綜合征布尼亞病毒（ Fever, thrombocytopenia and leukopenia syndrome Virus，F(xiàn)TLSV）。隨后,在我國湖北、山東、安徽、江蘇、遼寧等省也報(bào)道了相關(guān)的病例，同時(shí)該病毒在韓國，日本也先后被報(bào)道出來。隨后的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，該病毒在山區(qū)人群中血清陽性率在1%-3.8%之間。這項(xiàng)研究表明，該病毒可能在中國分布廣泛流行，但是只有一小部分感染人群發(fā)病。
　　SFTSV由L,M,S三

4、個(gè)片段組成，長度分別為6391bp，3397bp和1760bp，GC含量在48.45%-49.62%之間。L片段編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）, M片段編碼外膜蛋白Gn和Gc。S片段編碼核蛋白N和非結(jié)構(gòu)蛋白Ns分別位于正義鏈和負(fù)義鏈。SFTSV的媒介可能是蜱蟲。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)從家畜如牛、水牛、山羊和貓上采集到的長角血蜱（Haemaphyssalis，H. longicornis）和

5、微小牛蜱（Rhipicephalus microplus，R. microplus）能夠檢測(cè)到 SFTSV，這些SFTSV的核酸序列與人體發(fā)現(xiàn)的SFTSV具有高度的一致性。這表明SFTSV可能通過蜱蟲實(shí)現(xiàn)動(dòng)物與人之間傳染流行。目前已經(jīng)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)表明SFTSV可能會(huì)在人與人之間傳播。對(duì)于人類公共衛(wèi)生來說，SFTSV是一個(gè)潛在威脅。
　　由于該病毒是一個(gè)新發(fā)病原體，對(duì)于該病毒的分子進(jìn)化分析結(jié)果表明目前的流行的SFTSV存在五種主要的流

6、行型別，但是缺少進(jìn)一步的詳細(xì)的分子進(jìn)化方面知識(shí)。首先，SFTSV的祖先是什么時(shí)候產(chǎn)生的？SFTSV病是如何從起源地進(jìn)行傳播的？有沒有進(jìn)化規(guī)律和特征這些SFTSV的進(jìn)化問題不僅是病毒學(xué)家關(guān)心的研究課題,也是 SFTSV預(yù)防控制的公共衛(wèi)生核心問題之一。因?yàn)槠鹪磿r(shí)間、傳播路徑以及進(jìn)化動(dòng)態(tài)變化的信息對(duì)于SFTSV監(jiān)控和防治將提供主要的支撐作用。本研究通過本研究組分離的SFTSV的全基因組序列以及公用數(shù)據(jù)存在的基因組序列,對(duì)其進(jìn)行SFTSV系統(tǒng)的

7、分子研究。其次，SFTSV是新發(fā)的傳染病,對(duì)于其致病機(jī)制和流行病研究目前不多，同時(shí)也沒有有效的治療藥物，而且目前病例在多個(gè)地區(qū)報(bào)道且呈日漸增多的趨勢(shì)。本研究研制了基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)技術(shù)，以便及時(shí)給予 SFTSV疑似患者及時(shí)診斷，然后給以正確治療以降低疾病的病死率?；谏鲜鰞蓚€(gè)目的，本課題開展了關(guān)于SFTSV的遺傳進(jìn)化研究和核酸檢測(cè)方法的建立。
　　本研究分離和測(cè)序了12株SFTSV病毒，通過遺傳距離和一致性分析，表明這1

8、2株病毒遺傳距離很近。通過比對(duì)分析確認(rèn)了RNA依賴的RNA聚合酶功能區(qū)域Ⅰ-Ⅴ(區(qū)域Ⅰ[104-127],區(qū)域Ⅱ[649-707]，區(qū)域Ⅲ[904-1186]，區(qū)域Ⅳ[1190-1289]和區(qū)域V[1179-1289])，在功能區(qū)域Ⅲ確定了RNA依賴RNA聚合酶保守基序PreA[904-941]，A[976-1005]，B[1074-1093]，C[1118-1130]，D/E[1161-1186]。預(yù)測(cè)M基因編碼的外膜蛋白的Gn和Gc

9、的保守結(jié)構(gòu)域，位置分別在177-558位置，和563-996的位置；外膜蛋白前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，包含有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域（AA453-470，AA496-1035，AA1036-1058），在SFTSV的外膜蛋白上發(fā)現(xiàn)有2個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)、12個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖基化修飾位點(diǎn)、15個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)和三個(gè)位于部分毒株上的C-甘露糖基化修飾位點(diǎn)；確定了通過比對(duì)分析確定了N蛋白在白蛉熱病毒重保守氨基酸Tyr4, Phe11和Trp2

10、4。
　　進(jìn)化樹分析顯示L節(jié)段、S節(jié)段和M節(jié)段的樹形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都很相似，顯示SFTSV目前存在六種截然不同的基因型。通過進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)重配事件，重組事件分別涉及L、M和S節(jié)段，推斷基因重配可能是SFTSV進(jìn)化的潛在動(dòng)力之一。本研究推斷SFTSV的L、M和S三個(gè)節(jié)段的進(jìn)化速率，1.19×10-4(1.27×10-5–2.22×10-4,95%HPD)substitutions/site/year，2.42×10-4(8.07×

11、10-5–4.16×10-4,95%HPD)substitutions/site/year，2.28×10-4(4.35×10-5–4.48×10-4,95%HPD) substitutions/site/year；推斷了L、M和S三個(gè)節(jié)段的起源時(shí)間分別為191年以前（95%HPD=51-381）；182年以前（95%HPD=73-353）,294年以前（95%HPD=82-681）。綜上所述，可以推斷是SFTSV的起源時(shí)間距離目前18

12、2-294年以前。研究發(fā)現(xiàn)SFTSV的種群變化在很長的一段時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定；從1999開始，該病原體的有效群體數(shù)量開始迅速增長，這種趨勢(shì)一直持續(xù)到2008年，然后有效群體數(shù)量又下降的趨勢(shì)?；搓柹?、遼寧、日本、江蘇和浙江這五個(gè)地區(qū)的毒株是以本地的毒株進(jìn)化為主，而其余地方的毒株主要是輸入性毒株為主。確定了SFTSV可能起源于中國淮陽山區(qū)域，確立了四條主要傳播路徑。經(jīng)BF統(tǒng)計(jì)分析，淮陽山至山東（BF=9.74）,江蘇至山東（BF=3.35）

13、和江蘇至遼寧（BF=3.31）顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　通過SLAC, IFEL, FEL和FUBAR等軟件確定了SFTSV的四個(gè)蛋白主要選擇壓力為負(fù)選擇壓力，dN/dS值在0.048-0.14之間，其中M基因的dN/dS值比另外三個(gè)基因的高。通過MEME方法在SFTSV的三個(gè)蛋白上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)偶發(fā)性正選擇壓力位點(diǎn)。在L基因上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)正選擇位點(diǎn)(sites20,243,1653,1656和1749)，在M基因上共計(jì)發(fā)現(xiàn)了9個(gè)正選擇壓

14、力位點(diǎn)(sites322,384,553,638,641,650,925,955和1032)，在Ns蛋白上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位點(diǎn)228。這說明自然選擇壓力作用于 SFTSV是偶發(fā)的，同時(shí)說明這種選擇壓力可能會(huì)被負(fù)選擇壓力位點(diǎn)所掩蓋，MEME方法在檢測(cè)偶發(fā)性突變位點(diǎn)較其他方法有優(yōu)勢(shì)。
　　通過DEPS方法確定了定向進(jìn)化的位點(diǎn)，表明有一種選擇壓力存在促進(jìn)選擇適應(yīng)。在 L基因中共計(jì)檢測(cè)到了36個(gè)位點(diǎn)處于定向正選擇壓力下，氨基酸的取代趨于13個(gè)殘

15、基。在M基因中，共計(jì)檢測(cè)到了50個(gè)位點(diǎn)處于定向正選擇壓力之下，氨基酸的取代趨向于16個(gè)氨基酸。在Ns基因中共計(jì)檢測(cè)到了12個(gè)位點(diǎn)處于定向正選擇壓力之下，氨基酸的取代趨向與9個(gè)氨基酸。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了四個(gè)進(jìn)化分枝處于偶發(fā)性正選者壓力下。分別是2011YPQ17和2012YGS10毒株的L基因片段，YPQ2_2011毒株的M基因片段和2013038S毒株的Ns蛋白。
　　本研究建立了基于TaqMan的Real-time PCR方法檢測(cè)SFT

16、SV RNA，該方法檢測(cè)引起相同出血熱癥狀的病毒為陰性，最低檢出限為2-5copies分子/反應(yīng)，檢測(cè)79例SFTSV感染患者的急性期血清，陽性率為96%，表明本課題研制的方法具有良好的敏感性和特異性。進(jìn)一步評(píng)價(jià)臨床分析新能，共計(jì)檢測(cè)416例SFTSV疑似樣本，檢出317例陽性樣本，陽性檢出率為73.79%，說明該檢測(cè)方法可以用于臨床樣本檢測(cè)。
　　本研究對(duì)SFTSV的L、M和S基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)分析，對(duì)于外膜蛋白