基于牛膠原蛋白復合支架的組織工程人前板層半角膜的體外構(gòu)建及其鑒定研究.pdf

1、角膜(Cornea)位于眼球表面，為眼睛提供大部分屈光力，在維持人眼視功能中具有重要作用。角膜由于直接與外界環(huán)境接觸，故極易受到損傷和感染，造成視力下降甚至致盲。人角膜的組織結(jié)構(gòu)包括角膜上皮層(human cornealepithelium，HCEP)、前彈力層、基質(zhì)層(human corneal stroma，HCS)、后彈力層和內(nèi)皮層(human corneal endothelium，HCE)。其中，HCEP由多層HCEP細胞組成

2、，在維持角膜結(jié)構(gòu)的完整性以及保護角膜免受損傷和感染方面具有重要作用;HCS由200余層規(guī)則排列的膠原板層和散在分布于其中的HCS細胞組成，在維持角膜厚度和透明度方面作用重大。角膜位于眼表的最外側(cè)，最容易受到損傷和感染，在受到深度的創(chuàng)傷、灼傷和感染后，既會損傷HCEP又會傷及HCS，而且表層HCEP的損傷往往還會波及到其內(nèi)側(cè)的HCS，故前半層角膜損傷和病變的幾率很高。目前，前半層角膜病變治療的理想手段就是進行前半層角膜移植手術(shù)，但由于捐獻

3、角膜的高度匱乏致使絕大部分患者無法通過角膜移植手術(shù)復明。近年來，隨著角膜組織工程的興起和發(fā)展，體外構(gòu)建的組織工程人前板層半角膜(tissue-engineered human anterior hemi-cornea，TE-aHC)可作為捐獻角膜的等效替代物，為前半層角膜病變患者的臨床治療帶來希望，并已成為解決供體角膜不足的一種新的可行途徑。
　　在TE-aHC的體外構(gòu)建中，足量功能正常的種子細胞和生物相容性良好的載體支架是兩大關

4、鍵因素。但目前TE-aHC的相關研究甚少，所使用的種子細胞一般為永生化的角膜組織細胞系，或原代培養(yǎng)的角膜組織細胞，雖然仍具有細胞原有的特點，但因具有潛在致瘤性或數(shù)量有限從而限制了TE-aHC的體外構(gòu)建研究，尤其是其臨床應用。而目前所用的載體支架材料主要有脫細胞豬角膜基質(zhì)和重組人源膠原蛋白復合支架，雖然它們均具有較為理想的生物相容性，但因脫細胞豬角膜基質(zhì)存在有來源、宗教和病原體攜帶風險問題，而重組人源膠原蛋白復合支架價格昂貴和韌性欠佳等問

5、題，在很大程度上限制了其大規(guī)模應用。此外，在TE-aHC的體外構(gòu)建研究中，還存在有種子細胞接種后分布不均一、所構(gòu)建TE-aHC一體性較差等問題，也在很大程度上制約了TE-aHC的體外構(gòu)建。由于采用非酶解法提取的牛膠原蛋白具有完整的膠原分子結(jié)構(gòu)，不僅來源廣泛、有效避免了宗教倫理問題，而且在其提純過程中可以實現(xiàn)動物可能攜帶病原體的完全去除，能有效解決動物源性生物材料的安全問題，因此，本文選用牛膠原蛋白和硫酸軟骨素進行TE-aHC復合支架的制

6、備，進而以其為載體支架、以非轉(zhuǎn)染無致瘤性人角膜組織細胞系為種子細胞，首次利用“三明治”法聯(lián)合血纖蛋白交聯(lián)技術(shù)，進行了TE-aHC的體外構(gòu)建研究。
　　為了制備出生物相容性良好的牛膠原蛋白-硫酸軟骨素(bovinecollagen-chondroitin sulfate，BCOL-CS)復合支架，本文首次利用從牛跟腱中分離純化出的非酶解、完整分子膠原蛋白，制成130 mg/mL牛膠原蛋白溶液后進行凍干，以EDC/NHS為交聯(lián)劑并添加

7、硫酸軟骨素對所得牛膠原蛋白凍干薄片進行化學交聯(lián)，然后對其性質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)進行檢測。結(jié)果顯示，所制備出的BCOL-CS復合支架光學透明度高，透光率為62.55-93.04％，厚度約為90.2±10.7μm，含水量約77.45±4.44％，支架表面平整、呈致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支架內(nèi)部膠原纖維排列規(guī)則、緊密，表明利用純化牛膠原蛋白制備的復合支架與天然角膜的光學透明度、含水量及板層結(jié)構(gòu)相似，可以作為載體支架用于TE-aHC的體外構(gòu)建研究。
　　為

8、了獲得TE-aHC體外構(gòu)建的種子細胞，本文又對業(yè)已建立的非轉(zhuǎn)染HCEP細胞系和HCS細胞系細胞進行了體外擴增培養(yǎng)和鑒定。光鏡的形態(tài)觀察結(jié)果顯示，85代HCEP細胞和第28批第63代HCS細胞分別呈多角形鋪路石樣和纖維樣的細胞形態(tài);生長曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCEP細胞和HCS細胞的群體倍增時間分別為40.1 h和43.6 h;染色體分析結(jié)果證實，這兩種細胞的特征染色體數(shù)目均為2n=46條;免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，HCEP細胞能夠表達標志蛋白角

9、蛋白3/12以及功能蛋白——緊密連接蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白43、乙醛脫氫酶、鈉鉀泵和鈣泵;HCS細胞能夠表達標志蛋白波形蛋白以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白43、乙醛脫氫酶、鈉鉀泵和鈣泵。上述結(jié)果證實，體外擴增培養(yǎng)的HCEP細胞和HCS細胞仍然保持有原有細胞的形態(tài)、種屬特征、增殖活性以及發(fā)揮形成細胞連接和膜運輸功能的正常潛能，能夠作為種子細胞進行TE-aHC的體外構(gòu)建研究。
　　本文以BCOL-CS復合支架為載

10、體支架、以擴增培養(yǎng)的非轉(zhuǎn)染HCS細胞和HCEP細胞為種子細胞，利用“三明治”法聯(lián)合血纖蛋白交聯(lián)技術(shù)，進行了TE-aHC的體外構(gòu)建研究。在所制備的BCOL-CS復合支架上接種HCS細胞，利用“三明治”法聯(lián)合血纖蛋白交聯(lián)技術(shù)將4層已接種HCS細胞的支架疊置，進而在已獲得HCS樣結(jié)構(gòu)的表面接種HCEP細胞，氣-液交界培養(yǎng)5d構(gòu)建出TE-aHC。對其理化性質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)和潛在功能的檢測結(jié)果顯示，體外構(gòu)建的TE-aHC光學透明度高，透光率為19.8

11、5-90.85％; HCS細胞均勻分布于BCOL-CS復合支架之間，HCEP細胞形成了完整連續(xù)的4-6層復層上皮結(jié)構(gòu)，HCEP細胞和HCS細胞仍然保持有其標志蛋白及功能蛋白的陽性表達。所有這些結(jié)果表明，本文體外構(gòu)建出的TE-aHC具有與活體角膜的前半層高度相似的理化性質(zhì)、細胞屬性、組織結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達模式，具有發(fā)揮前半層角膜正常功能的潛力。
　　綜上所述，本文首次以非酶解、完整分子的牛膠原蛋白為主要材料制備出BCOL-CS復合支