基于脫細胞豬角膜基質(zhì)的組織工程全層人角膜的體外重建、鑒定及其在動物移植中的作用研究.pdf

1、角膜是位于眼表的透明組織,主要行使屈光的功能。由于角膜直接與外界環(huán)境接觸,因此極易受到機械外傷、熱灼傷以及微生物的感染,導(dǎo)致角膜病的發(fā)生,嚴重者甚至失明。角膜移植是唯一的治療方法。但是,目前所需的供體角膜數(shù)量嚴重匱乏,遠遠不能滿足臨床的需要。隨著角膜組織工程的興起與發(fā)展,組織工程人角膜(Tissue-engineered Human Cornea,TE-HC)有望成為捐獻角膜的等效替代物,從而解決供體不足的問題,為角膜病盲患者帶來復(fù)明的

2、希望。TE-HC體外重建的核心要素主要包括兩方面:一是能夠獲得足量的、形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能正常的人角膜種子細胞;二是制備出與種子細胞具有良好生物相容性的載體支架。目前用于TE-HC的種子細胞主要有胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)、原代培養(yǎng)細胞、成體干細胞(adult stem cells, ASC)以及轉(zhuǎn)染細胞系細胞; ESC應(yīng)用引起的倫理問題、原代培養(yǎng)細胞的數(shù)量限制、ASC誘導(dǎo)分化率低以及轉(zhuǎn)染細胞系細胞的潛在致瘤

3、性風(fēng)險,限制了這些細胞在角膜組織工程中的應(yīng)用;載體支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料構(gòu)建的載體支架存在的機械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性較差限制了其作為組織工程角膜載體支架的應(yīng)用。因此尋找理想的角膜種子細胞以及載體支架材料成為體外成功重建TE-HC的關(guān)鍵因素。
　　本文采用的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的 HCEP(human corneal epithelium, HCEP)細胞、基質(zhì)(huma

4、n corneal stroma, HCS)細胞以及內(nèi)皮(human corneal endothelium, HCE)細胞,具有角膜細胞的正常屬性及功能,并且體外增殖能力強,短時間內(nèi)即可獲得大量的細胞,從而作為理想的種子細胞解決了TE-HC體外重建的種子細胞來源問題。而在載體支架方面,經(jīng)本實驗室前期的研究、探索及優(yōu)化,制備出了具有透光率高、生物相容性好的脫細胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal stroma

5、, aPCS),成為體外重建TE-HC的理想載體支架材料。
　　為了進一步鑒定HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞的屬性、功能蛋白的表達以及是否具有潛在的致瘤性,本文對第70代的HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞進行了復(fù)蘇、擴增培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示,復(fù)蘇的第70代HCEP細胞和HCE細胞均呈典型上皮細胞型,而HCS細胞呈典型成纖維細胞型。HCEP細胞、HCE細胞的細胞與細胞之間緊密相靠、互相銜接,排列呈現(xiàn)“鋪路石”狀,具有連

6、接成片的能力,而 HCS細胞排列呈流線型。HCEP細胞、HCE細胞以及HCS細胞的群體倍增時間分別為39.6 h、38.6 h和36.5 h,三種細胞的活力良好,增殖分裂旺盛,特征性染色體數(shù)目仍均為2n=46。功能蛋白的表達檢測結(jié)果顯示,HCEP細胞能夠表達HCEP特異性標志蛋白---角蛋白3和12,以及鈉鉀泵和整聯(lián)蛋白,表明該細胞仍具有角膜上皮的表型,且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能;HCS細胞能夠表達HCS特異性標志蛋白---波形蛋

7、白,以及乙醛酸脫氫酶 ALDH3A1及整聯(lián)蛋白,表明該細胞仍具有角膜基質(zhì)細胞的潛能;而HCE細胞能夠表達鈉鉀泵、緊密連接蛋白 ZO-1及整聯(lián)蛋白,表明該細胞仍具有角膜內(nèi)皮的表型,且具有形成完整HCE結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗結(jié)果顯示,這三種角膜種子細胞安全性好,均無致瘤性。因此,HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞可作為體外重建TE-HC的理想種子細胞。
　　為了獲得理想的載體支架,本文以帶后彈力層的豬角膜為研究材料,應(yīng)用0.5％脫

8、氧膽酸鈉及0.04%原釩酸鈉聯(lián)合 DNA-RNA酶對豬角膜進行脫細胞處理,通過風(fēng)干的方法制備出理想的 aPCS載體支架材料,并對其進行了形態(tài)功能鑒定和生物相容性研究。石蠟切片HE染色和冰凍切片DAPI染色結(jié)果顯示,aPCS無任何細胞殘留;阿利新蘭染色結(jié)果顯示胞外基質(zhì)糖胺聚糖(GAG)的分布與對照相似;而掃描電鏡結(jié)果顯示aPCS后彈力層面及基質(zhì)面光滑平整;透射電鏡結(jié)果顯示構(gòu)成aPCS膠原板層的膠原纖維排列整齊規(guī)則。為了檢測aPCS的生物相

9、容性,我們制備了aPCS浸提液,并進行了浸提液對HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞的細胞活力及細胞毒性的檢測,結(jié)果顯示aPCS浸提液對三種細胞的生長均無影響,不影響細胞的增殖,也不引起細胞的凋亡,沒有對細胞產(chǎn)生毒性。因此,aPCS可以作為體外重建TE-HC的理想載體支架。
　　為了建立TE-HC體外規(guī)?；亟ǖ募夹g(shù)工藝條件,在獲得了理想的種子細胞和載體支架材料后,我們進行了TE-HC的體外重建研究。首先采用微量注射的方法將 H

10、CS細胞接種于 aPCS支架的基質(zhì)中,然后將其置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24 h;其次,將接種過HCS細胞的植片放于插入式培養(yǎng)皿中,后彈力層面朝上,將 HCE細胞接種于aPCS的后彈力層面,培養(yǎng)24 h后反轉(zhuǎn)植片,后彈力層朝下,接種HCEP細胞,采用氣-液界面培養(yǎng)方法持續(xù)培養(yǎng)5 d,從而重建出了TE-HC,并對其形態(tài)結(jié)構(gòu)及細胞功能蛋白表達進行了鑒定。茜

11、素紅染色結(jié)果顯示HCE細胞在后彈力層面形成了連續(xù)的細胞單層;石蠟切片HE染色結(jié)果顯示aPCS支架內(nèi)基質(zhì)細胞伸展良好,與支架材料結(jié)合緊密;而HCEP細胞在aPCS支架基質(zhì)層表面形成了6-7層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu),類似于正常角膜的結(jié)構(gòu);免疫組化染色結(jié)果顯示TE-HC的 HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞的標志性蛋白、功能蛋白表達均呈陽性,與正常細胞的表型和功能相同。上述結(jié)果表明以帶后彈力層的 aPCS為載體支架、以第70代 HCEP細胞、HC

12、S細胞以及HCE細胞為種子細胞體外成功重建出了TE-HC,具有與活體角膜相似的組織結(jié)構(gòu),其種子細胞具有功能蛋白的陽性表達,表明可能具有全角膜的生物學(xué)功能。
　　為了鑒定體外重建 TE-HC的生物學(xué)功能,本文選用新西蘭兔和比格犬進行了TE-HC的穿透性角膜移植實驗,并通過過裂隙燈顯微鏡觀察、角膜厚度以及眼壓測定等方法來評估在體TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。結(jié)果顯示,新西蘭兔術(shù)后前10 d,角膜水腫,眼壓偏高;第20 d,

13、水腫狀況減輕,眼壓恢復(fù)正常;第30 d,角膜部分透明。比格犬移植實驗結(jié)果顯示,在術(shù)后前期,植片水腫,眼壓升高,但是30 d后,角膜重新上皮化,眼壓恢復(fù)正常,角膜水腫減輕,但是還是未恢復(fù)到正常角膜厚度,目前我們已觀察至270 d,發(fā)現(xiàn)角膜新生血管情況好轉(zhuǎn),但是術(shù)眼角膜厚度還是高于正常角膜。
　　綜上所述,本文以具有正常屬性和功能的第70代HCEP細胞、HCS細胞以及HCE細胞為種子細胞,以具有良好生物相容性的 aPCS為載體支架,體