產(chǎn)β-半乳糖苷酶的節(jié)桿菌突變株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化與酶基因保守序列分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)是一種能夠同時催化水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的酶,它可以將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖;半乳糖在其轉(zhuǎn)苷酶活的作用下,與果糖作用生產(chǎn)乳果糖。Β-半乳糖苷酶本身的酶學(xué)性質(zhì)決定了其可以廣泛應(yīng)用于乳糖的降解(如水解乳制品中的乳糖以解決乳糖不耐癥等)和功能性低聚糖的生產(chǎn)(如乳果糖、低聚半乳糖等)。本實驗室從土壤中篩選得到一株節(jié)桿菌Arthrobacter sp.,其β-半乳糖苷酶同時具有水

2、解與轉(zhuǎn)苷兩種酶活性。本文從如下4個方面對該菌株進(jìn)行了進(jìn)一步研究:
　　 為了提高菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力,首先利用亞硝基胍-氯化鋰復(fù)合誘變,再利用紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變,篩選出一株誘變菌Arthrobacter sp.U14,經(jīng)過實驗證明該菌株β-半乳糖苷酶對底物ONPG的酶活達(dá)到2.65 U/mL,比出發(fā)菌株酶活0.465U/mL提高470％。
　　 由于節(jié)桿菌Arthrobacter sp.所產(chǎn)β-半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶

3、,所以在篩選β-半乳糖苷酶活性提高的菌株的過程中,建立了一種溶菌酶與SDS復(fù)合處理裂解細(xì)胞,細(xì)胞裂解液與X-gal反應(yīng)顯色進(jìn)行高產(chǎn)菌篩選的方法。溶菌酶終濃度4mg/mL,37℃水浴1.5 h,再加入SDS終濃度1％,37℃水浴20 min。通過該方法可以有效縮小高產(chǎn)菌株的篩選范圍,減少工作量,縮短工作時間,同時保持較高的篩選準(zhǔn)確度。
　　 以菌株Arthrobacter sp.的乳糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ),采用響應(yīng)面法,對影響Arthro

4、bacter sp.U14產(chǎn)β-半乳糖苷酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察和評價。優(yōu)化后發(fā)酵條件:在自然pH值條件下,當(dāng)乳糖濃度為5.4％,酵母抽提物濃度5.1％,Fe3+濃度0.93 mM時,β-半乳糖苷酶理論預(yù)測最大酶活為3.7U/mL。優(yōu)化后實際測定平均酶活為3.85U/mL。比優(yōu)化前酶活提高45.3％。
　　 根據(jù)已公開發(fā)表的節(jié)桿菌β-半乳糖苷酶保守區(qū)域序列設(shè)計引物,對Arthrobacter sp.與Arthrobacte