核酸適體在蛋白質(zhì)和小分子檢測中的新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)如免疫球蛋白E及小分子如腺苷等生物分子在維系生物個體的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。對這些生命物質(zhì)進行快速而有效的監(jiān)測對保持生個體正常的機能有著直接而現(xiàn)實的意義。生物傳感器在眾多分析方法中獨樹一幟,他不僅具有常規(guī)分析方法的優(yōu)點,而且能模擬生命活動過程,能提供原位、實時分析。核酸適體是一段自核酸文庫中隨機篩選出的功能化單鏈短DNA或RNA序列,具有化學(xué)穩(wěn)定,尺寸小,價格低廉,高親和力,高特異性以及靶物質(zhì)廣泛等的特點,這使它在構(gòu)建一系

2、列目標分子檢測體系中成為人們的首選。本文以核酸適體為目標識別探針,主要在以下幾個方面開展工作:
　　 (1)基于G四股螺旋和信號增強的熒光寡核苷酸探針用于蛋白質(zhì)的超靈敏檢測[第2章]。本章中,我們報道了一種標記芘的富G核酸探針及其在IgE檢測中的應(yīng)用,為探究人類端粒的生物學(xué)功能提供了有益的參考?；诜肿娱gG四股螺旋結(jié)構(gòu),結(jié)合S1核酸酶和目標識別核酸適體,我們設(shè)計了一種末端單芘標記的寡核酸探針并提出一種新的蛋白質(zhì)檢測方法。該方法不

3、僅有效回避了報告基團特異性位點優(yōu)化和芘單體熒光易被核酸堿基猝滅的問題,同時還提出了一種信號增強的響應(yīng)機理,成功用于均相中IgE超靈敏檢測。該傳感器的線性范圍為4.72×10-12～7.56×10-9M,回歸系數(shù)為0.9941,檢測下限9.45×10-14M。
　　 (2)基于背景消除和信號增強的電化學(xué)核酸適體傳感器用于小分子超靈敏檢測[第3章]。本章中,我們以腺苷為目標模型提出了一種多功能的電化學(xué)核酸適體傳感機理用于小分子的超靈

4、敏檢測。巰基修飾的核酸適體探針上標記二茂鐵電活性分子,并將其固定在電極表面,在核酸適體序列的兩端引入大腸桿菌核酸內(nèi)切酶Ⅰ的酶切位點,這不僅能夠扣除背景電流,同時形成一種信號增強的響應(yīng)機理。沒有目標物腺苷存在時,核酸適體折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在莖部形成一個酶切雙鏈區(qū),酶切后二茂鐵脫離電極表面,沒有二茂鐵的響應(yīng)電流信號產(chǎn)生。有腺苷存在時,腺苷和核酸適體結(jié)合誘導(dǎo)核酸適體發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變,酶切雙鏈區(qū)域消失,核酸內(nèi)切酶就無法切斷適體探針序列。此時二茂鐵分子

5、仍離電極表面很近,故能夠觀察到二茂鐵的響應(yīng)電流峰。這種傳感檢測體系,在腺苷濃度極低的情況下仍能檢測到電流信號。檢測下限達到10-13M,線性響應(yīng)范圍為3.74×10-12～3.74×10-8M。我們提出的這種新型電化學(xué)傳感檢測方法極大的拓展了各種基于核酸適體傳感體系用于目標檢測的分析范圍。
　　 (3)基于分子信標核酸適體熒光生物探針用于腺苷的高選擇性檢測[第4章]。本章中,基于核酸適體結(jié)合目標誘導(dǎo)構(gòu)型轉(zhuǎn)換和DNA雜交原理,以腺