蚯蚓纖溶蛋白的分離純化及其對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附影響的研究.pdf

1、蚯蚓，又名地龍，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，具有活血化瘀、痛經(jīng)活絡(luò)之功效。1983年日本學(xué)者從蚯蚓體內(nèi)分離得到了一組具有纖維蛋白溶解能力的酶類物質(zhì)，并將之命名為蚓激酶，視之為一種新型溶栓藥物。自此，關(guān)于蚯蚓藥理活性組分的研究越來越受到科研工作者的關(guān)注。隨著對(duì)其藥理作用研究的深入，蚯蚓抗腫瘤作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，但以往關(guān)于蚯蚓抗腫瘤活性的研究多集中于其粗提取物的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，我們的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也表明其提取物確實(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而且其鹽析

2、產(chǎn)物除抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)外還可以降低細(xì)胞粘附性。因此，本文以赤子愛勝蚓為原料，以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株為研究對(duì)象，對(duì)新鮮赤子愛勝蚓體內(nèi)的抗腫瘤活性蛋白成分進(jìn)行了分離純化以及鑒定，以篩選活性最強(qiáng)的蛋白組分，并探索其抗腫瘤細(xì)胞粘附的作用機(jī)制以及與紫杉醇聯(lián)合使用后的抗腫瘤作用的變化，具體實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果見下文:
　　1、蚯蚓抗腫瘤蛋白(EFP)的分離純化及鑒定。
　　實(shí)驗(yàn)以CCK-8法來檢測(cè)蚯蚓提取物作用于MCF-7細(xì)胞后的細(xì)胞存活

3、率，并結(jié)合得率來篩選抗腫瘤活性較高的蛋白成分。分離純化過程為:制備勻漿，取上清液進(jìn)行飽和硫酸銨分級(jí)鹽析，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選各級(jí)蛋白沉淀抗腫瘤活性，然后經(jīng)DEAE陰離子交換層析，S200凝膠層析，G10脫鹽等過程得到一個(gè)具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的單一蛋白，即EFP。
　　對(duì)該蛋白進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè)，電泳分析得到其分子量在25kDa左右，纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)顯示EFP具有非常強(qiáng)的纖維蛋白溶解作用，經(jīng)北京華大蛋白質(zhì)研究中心檢測(cè)，LC-MS等結(jié)果顯示，EFP與

4、赤子愛勝蚓纖溶酶A(Q8MX72)具有高度相似性。
　　2、EFP的抗腫瘤活性以及抗粘附機(jī)制研究
　　采用CCK-8法檢測(cè)EFP的抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，結(jié)果表明EFP可以顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)存活，作用弱于紫杉醇。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EFP可以顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移。此外，實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，EFP具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞粘附作用，經(jīng)RT-PCR以及WesternBlot檢測(cè)粘附因子FAK、CD44v6的表達(dá)，結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)，EFP可以顯著下調(diào)FAK、CD44v6在mRNA以及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，這表明EFP的抗細(xì)胞粘附作用可能與下調(diào)FAK、CD44v6的表達(dá)有關(guān)。
　　3、EFP與紫杉醇聯(lián)合使用后抗腫瘤細(xì)胞活性的檢測(cè)
　　使用CCK-8法檢測(cè)EFP與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用之后抗腫瘤活性的變化，結(jié)果表明，二者聯(lián)合使用具有協(xié)同效果，紫杉醇的活性顯著增強(qiáng)。采用免疫熒光法檢測(cè)EFP與紫杉醇單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用時(shí)MCF-7細(xì)胞內(nèi)β-tublin的變化，結(jié)果

6、表明，單獨(dú)使用EFP對(duì)β-tublin并無明顯作用，而聯(lián)合使用組與單用紫杉醇組β-tublin的變化也無顯著差異，這表明EFP不能增強(qiáng)紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力。
　　綜上所述，EFP，即蚯蚓纖溶酶A，具有抑制MCF-7細(xì)胞生遷移、抗細(xì)胞粘附的作用，而且EFP還可以下調(diào)FAK、CD44v6的表達(dá)。與紫杉醇聯(lián)合使用后，作用強(qiáng)度增加，而且該增強(qiáng)作用與EFP增加紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力無關(guān)。
　　本文對(duì)蚯蚓抗腫瘤活性蛋白EF